- •Біотехнологія в медицині План
- •1.Антибіотики
- •2. Стероїди
- •3.Моноклональні антитіла
- •Загальна схема одержання гібридом (імплантація in vitro)
- •4. Одержання хімічних речовин з біомаси рослин
- •Будова біосенсорів
- •Типи біосенсорів за будовою та функціями.
- •Умови функціонування біосенсорів
- •Практичне застосування біосенсорів
4. Одержання хімічних речовин з біомаси рослин
На відміну від мікроорганізмів, культури клітин вищих організмів є порівняно новим об’єктом біотехнології. На їх життєдіяльності базується виробництво білогічно активних сполук, вакцин, моноклональних антитіл.
Вперше вдалося ввести в культури клітини тварин на початку ХХ століття. Перші успіхи по культивуванню рослинних клітин відносять до 30-х років, але розвиток цього напрямку відносять до 60 - 70-х років ХХ ст. У 70-ті роки розроблено спосіб одержання протопластів рослин, а також відкриття гібридизації соматичних клітин.
Культивують рослинні клітини у вигляді:
► каллюсної тканини;
► суспензійних культур;
► поодиноких клітин.
Каллюсна тканина (ранева) у природі характерна для травмованих рослин. Для її одержання шматочок тканини (клітину) поміщують на штучне напіврідке поживне середовище у пробірки, колби, чашки Петрі. Для цього стерилізують як експлантанти (розчинами, які містять СІ, Hg), так і поживні середовища (в автоклаві або ультрафільтруванням). Всі маніпуляції проводять в асептичних боксах.
Клітини з будь-яких тканин рослини в культурі втрачають властиву їм структурну організацію і функції (дедиференціюються), після чого індукуються до поділу, утворюючи первинний калюс.
Основними компонентами поживних середовищ для культивування клітин і тканин рослин є мінеральні солі, джерело вуглецю (сахароза або глюкоза), вітаміни, регулятори росту + органічні добавки (гідролізат дріжджів та ін.).
Калюсну тканину використовують для одержання з неї рослин (соматичних гібридів, безвірусних рослин та ін.), а також для збереження в стані росту колекцій різних штамів, ліній, мутантів, з неї одержують, також, суспензії клітин, які культивують на рідкому поживному середовищі.
Суспензійні культури – це суміш поодиноких, 3-5 і навіть >50 з’єднаних клітин, які вирощують у завислому стані. Їх одержують перемішуючи в колбах на качалалках калюсну рихлу тканину. Можна отримати суспензію і з фрагмента рослини, але це більш трудоємкий процес.
Джерело окремих клітин – ізольовані протопласти або суспензійні культури.
Рослини здавна є постачальниками хімічних сполук для хімічної промисловості. Це не лише така сировина як цукри, але і цілий ряд складних вторинних метаболітів, наприклад каучук, кокаїн, речовини, що використовуються в якості барвників, смакових добавок, прянощів. Одержати такі речовини шляхом хімічного синтезу часто неможливо із-за складності їх будови. Сьогодні вчені, біотехнологи не лише шукають способи покращення виробництва вже освоєної продукції (аймалін, кодеїн) але і працюють над одержанням нових продуктів. У найближчі роки хочуть заставити гени рослин працювати в бактеріальних клітинах.
Працюючи з культурами тканин рослин можна контролювати утворення необхідних речовин (ліків, цінних хімічних речовин) не думаючи про погоду, шкідників та ін.
Культури рослинних тканин можна отримати з будь-якого виду рослин. При цьому використовують різноманітні середовища. Пізнання особливостей фізіології і біохімії дозволило значно підвищити їх врожайність і вихід біомаси з цих культур (20-30г/л). але багато таких культур не можуть вважатися автотрофами, так як для їх росту необхідне зовнішнє джерело вуглецю (у вигляді глюкози чи сахарози), азот, мінеральні речовини і фактор росту. Вихід різних речовин (необхідних людині) може бути у 10 разів більшим, ніж у звичайній рослині. Але для цього необхідні нові стратегії скрінінгу і селекції. Підвищений вихід цих речовин вдається лише за рахунок зниження біомаси і пригнічення росту.
З проблемами біотехнології рослинних клітин можна ознайомитися на прикладі організації добування однієї речовини, одержаної з культури тканин рослини.
Відомо, що корені рослини Lithospermum erytrorhizon містять шиконін і його похідні. В Японії ця рослина здавна використовувалася як лікарська, так як має антибактеріальну і протизапальну дію. Шиконін – яскраво-червона речовина, тому її здавна застосовували і як барвник. Для того, щоб концентрація шиконіну в корені досягла 1-2% вік рослини повинен досягти 5-7 років. Вирощувати цю рослину в промислових масштабах в Японії не можливо, тому її завозили з Кореї та Китаю і вартість чистої речовини становила 4500$ за 1кг. Тому вони налагодили промислове виробництво на основі культури тканин рослини.
Клітини рослин не виділяють вторинні продукти в середовище, а запасають їх у вакуолях і органелах, що ускладнює їх одержання, але відбір найбільш продуктивних ліній полегшився тим, що клітини, які містять шиконін, мають яскраво-червоне забарвлення. Селекцією вдалося виділити лінію, яка накопичує до 15% шиконіну на суху масу. Наступна операція – оптимізація середовища – ще збільшила продуктивність виробництва.
Розроблений 2-х ступеневий процес культивування:
-
створюються оптимальні умови для росту біомаси у ферментері на 200л;
-
створюються умови для утворення вторинних метаболітів в апараті на 750л.
Клітини вирощують у суспензійній культурі. Для цього більш підходять ерліфтні ферментери, так як в них одночасно проходить інтенсивне перемішування і розділення клітин при малій (min) вірогідності пошкодження клітин.
Екстракцію проводять звичайними хімічними методами (кислотою). Вихід продукту за один цикл – 5кг. Шиконін можна виділити й іншим способом – зміною рН або ж додаванням деяких речовин, що впливають на проникаючу здатність клітин, наприклад диметилсульфоксид.
Такий підхід може бути корисним при використанні іммобілізованих клітин: завдяки селективній проникності можна буде постійно видаляти вторинні метаболіти з вакуолів без глибокого порушення первинного обміну речовин. Так, клітини Catharanthus, імобілізовані а альгінат-акриламідній матриці, у великих кількостях виділяють в середовище аймалін і серпентін.
Для одержання ряду алкалоїдів, похідних індолу (вінбластін, вінкрістін, аймалін) дя лікування раку можна використовувати і барвінок Catharanthus roseus, який містить дані речовини. Концентрація їх дуже мала і в суміші з іншими алкалоїдами. Крім того, в культурах тканин вони не утворюються, а утворюються їх асиметричні димери (катарантін, вінділін). Димери потім можна синтезувати хімічним шляхом.
Культивовані тканини рослин застосовують також для проведення біотрансформації. Наприклад, утворення стимулюючого роботу серця дигоксину шляхом 12-β-гідроксилювання дигітоксину проводиться в суспензійних культурах або в імобілізованих клітинах наперстянки Digitalis lanata. На основі цих систем, а також імобілізованих клітин моркви вдалося синтезувати ряд нових карденолідів.
Методи культивування тканин рослин застосовувалися і для покращення сортів с/г культур: підвищення їх стійкості проти хвороб і несприятливих умов середовища, підвищення вмісту сахарози і крохмалю, підвищення урожайності, а також для виведення більш продуктивних порід деревини – джерела лігноцелюлози, рослин - продуцентів еластомерів (гваюла, молочай) або олії (олійна пальма, соя).
Перспективи багатообіцяючі. Це нові ліки, засоби захисту рослин, косметика і парфуми, підсолоджувачі. Можливості розширюються завдяки розробці способів одержання гібридів шляхом злиття протопластів.
Таблиця 2
Джерело рослинних культур |
Продукт |
Застосування |
Ціна за 1 кг в $ |
Catharanthus roseus (барвінок) |
Вінбластін або вінкрістін, аймолін, серпентін |
Лікування лейкемії |
5000 |
Digitalis lanata (наперстянка) |
Дигоксин (дигітин) |
Лікування серцево-судин. захворювань |
3000 |
Cinchna ledgeriana (хінне дерево) |
Хініни |
Лікування малярії |
100 |
Papaver somniferum ( мак снотворний) |
Кодеїн |
Седатив |
650 |
Erythroxylon |
Кокаїн |
Седатив |
|
|
Жасмин |
Для парфюмерії |
5000 |
Chrysantemum cinarariarfolium (хризантема) |
Піретрин |
Інсектицид |
3000 |
Coptus japonica; Euphortia millii (гібрид, одержаний злиттям протопластів) |
Берберин |
Антибактеріальний засіб для лікування тифу |
|
5. Наука про біосенсори, знаходиться на межі між різними областями знань, не тільки являє собою новий напрям у біотехнології, але й відображає науково-технічний рівень країни. Створення біосенсорів базується на досягненнях у біології, хімії, фізиці, мікроелектроніці.
Біосенсор – аналітичний пристрій який селективно реагує на концентрацію хімічних сполук у біологічних зразках. Згідно цього визначення, любий датчик який працює в біологічному середовищі, може розглядтися як біосенсор.