Біотехнологія в медицині План

1. Виробництво антибіотиків.

2. Трансформація стероїдних препаратів.

3. Одержання моноклональних антитіл

4. Одержання ліків з біомаси рослин.

5. Біоcенсори.

6. Застосування імобілізованих ферментів у медицині.

1.Антибіотики

Це низькомолекулярні речовини різної хімічної будови. Спільне те, що вони є продуктами життєдіяльності мікроорганізмів, і в той же час в дуже малих концентраціях специфічно порушують їх ріст, метаболічні процеси. Це вторинні метаболіти (тобто. як і токсини, алкалоїди не потрібні для забезпечення росту та розвитку мікроорганізмів). Це ідіоліти – їх біосинтез відбувається в клітинах, що пройшли стадію інтенсивного росту (трофазу) – в ідіофазі.

Біологічна роль їх до кінця не вивчена. Вчені вважають, що в несприятливих умовах вони пригнічують ріст конкуруючих мікроорганізмів, забезпечуючи більш сприятливі умови для виживання мікрооганізму – продуцента. Відомо близько 5000 – 6000 антибіотиків продуцентами яких є :

• шість родів нитчатих грибів (Cephalosporium, Penicillinum);

• три роди актиноміцетів (виробляють близько 4000 антибіотиків, в основному це рід Streptomices, що дає 70 % загальної їх кількості);

• два роди бактерій (виробляють близько 500 антибіотиків).

Але для реалізації і споживання виробляється більше 100 різновидів. Головну частину продукції яка реалізується складають п’ять груп антибіотиків:

1. Пеніциліни

2. Цефалоспорини

3. Еритроміцини

4. Тетрацикліни

5. Стрептоміцини.

У той час, коли встановили антибактеріальну дію пеніциліну (Флорі, Чейн, 1941р.), продуктивність лабораторного штаму плісняви (2 мг. на 1 л. культуральної рідини), була зовсім недостатньою для налагодження промислового виробництва. Збільшити вихід вдалось використовуючи серії мутантів, одержаних під впливом ультрафіолетового, рентгенівського випромінювання, азотистого іприту, зміни умов вирощування, стихійних мутацій. Молекулярний механізм синтезу багатьох антибіотиків, ще до кінця не вивчений. Відбором найкращих продуцентів вдалося підвищити продуктивність гриба в 10 000 разів, і довести концентрацію пеніциліну в культуральній рідині до 2 %. Були виділені нові антибіотики, які дають ефект при грамнегативних бактеріях:

• Стрептоміцин (синтезується бактеріями Actinomicetes роду Streptomicetes);

• цефалоспорин (продукується пліснявим грибом Cephalosporium, що належить до  - лактамних антибіотиків, але не викликає алергічної реакції).

З початком промислового виробництва пеніціліну в 40 – х роках з’явилось ряд нових проблем, які вдалося вирішити за допомогою біотехнології. По – перше, успішне застосування пеніциліну визвало більшу потребу в цьому лікувальному препараті, і для цього необхідно було різко підвищити вихід пеніциліну у виробництві. По-друге, перший пеніцилін (пеніцилін G, бензилпеніцилін), діяв переважно на грампозитивні бактерії (Streptocccus, Staphylocccus), а необхідний більш широкий спектр дії, і активності на грамнегативні бактерії (E. coli, Pseudomnas). По–третє, пеніцилін був не стабільний в кислому середовищі, і його не можна застосовувати перорально (як пігулки). По–четверте, пеніцилін може викликати алергічні реакції в деяких людей, і тому необхідний певний асортимент засобів для вибору не алергенного препарату. І нарешті, багато бактерій набувають стійкість до дії антибіотиків, завдяки утворенню у бактерій роду Staphylocоccus ферменту  -лактамази (пеніцилінази), яка викликає гідроліз -лактамного кільця з утворенням неактивної пеніциланової кислоти.

Пеніцилін та його похідні.

Природний пеніцилін, який виробляється деякими видами зеленої плісняви (Penicillіum), являє собою суміш речовин загальною формулою:

S CH₃

R – C – HN CH CH C CH₃

O

O=C N CH – COOH

 - лактамне кільце

6 – амінопеніциланова кислота ( 6 - АПК)

Основним продуцентом пеніциліну є Penicillin chrizogenum. Виявилось, що при введенні в середовище карбонових кислот, або їх похідних переважно утворюється той пеніцилін, який містить боковий ланцюг введеної кислоти. Одержані таким чином пеніциліни називають біосинтетичними. Так у присутності фенілоцтової кислоти (R=С₆Н₅СН₂), утворюється пеніцилін G, параоксифенілоцтової кислоти (R=НОС₆Н₄СН₂) – оксибензилпеніцилін, феноксиоцтової кислоти (R=С₆Н₅ОСН₂) – феноксиметилпеніцилін. Феноксиметилпеніцилін стійкий до дії кислот, його застосовують перорально тому, що в кислому середовищі шлунку такі похідні, як бензилпеніцилін розкладаються. Але багато цінних перспективних пеніцилінів одержати біосинтетичним шляхом не вдається, так як введені попередники вступають в неконтрольовані процеси. Вихід, що запропонували біохіміки, (розпочалося виробництво ще в 60 – х. роках), це так званий напівсинтетичний метод. Всі ці сполуки – похідні 6 – АПК, яка має незначну антибіотичну активність. Важливим її елементом є наявність  - лактамного кільця, характерного і для інших антибіотиків (цефалоспорини), це  - лактамні антибіотики Зміна групи R-радикалу призводить до зміни властивостей та біологічної активності антибіотиків. Молекула 6-АПК легко вступає в реакцію з хлорангідридами карбонових кислот, з утворенням великої кількості аналогів.

S CH₃

RCOCI + 6 -AПK R – C – NH CH₃ + HCI

O

O=C N COOH

Але, хімічний синтез 6-АПК дуже трудоємний для промисловості, оскільки для цього необхідні: температура (–40⁰С), ряд розчинників. Хімічний гідроліз бензилпеніціліну йде по використанню амідного зв’язку напруженого  -лактамного кільця.

Розщеплення антибіотика проводять за допомогою ферменту пеніцилінамідази, без втрати  - лактамного кільця.

Для виробництва найбільш розповсюдженого антибіотика - пеніциліну (G), використовують високопродуктивні промислові штами Penicillium chrizogenum, який вирощують в 100 000 літрових ферментерах в присутності фенілоцтової кислоти на багатому поживному середовищі. Для забезпечення безперервного виходу 14-15 ферментерів працюють в змінному режимі (їх загружають почергово), так як мікробіологічна стадія виробництва пеніциліну триває протягом 200 годин, а видалення продукту з ферментера - 15 годин. Після закінчення ферментації мікроорганізми і культуральну рідину розділяють фільтруванням, а клітини плісняви промивають. З фільтрату і промивної рідини в кристалізаторах, з допомогою бутанолу та йонів калію (К⁺) одержують кристалічну калієву сіль пеніциліну (99,5%). Цей антибіотик є вихідною речовиною для одержання подальших хімічних модифікацій.

Оброблений ферментом пеніцилінамідазою (продуцент спеціальний штам), при 37⁰С, у водному середовищі бензилпеніцилін перетворюється в 6-АПК. Вивчені кінетика та механізм дії ферменту пеніцілінамідази, способи його імобілізації та стабілізації. Фермент легко включається у поліакриламідний гель, модифікований глутаровим альдегідом, і достатньо стабільний. Процес з використанням імобілізованої пеніцилінамідази введений у виробництво в 30 – х роках, це дозволило виробляти пеніциліни з :

• високою активністю до великої кількості мікробів;

• малою токсичністю для організму людини, та без побічної дії.

S CH₃

CH₂ – C – HN CH₃ Пеніцілінамідаза

O 6-AПК + фенілоцтова

O=C N COOH кислота

Бензилпеніцилін (пеніцилін G)

Пеніцилінамідазі властива також специфічність і до гідролізу цефалоспоринів. Цим способом отримано 7- АЦК, це шлях до дуже перспективних ліків на основі цефалоспоринів. У цефалоспоринах можуть модифікуватися два бокових ланцюги.

S

R Н₂N

O=C N CH₂ – O – C – CH₃

O

COOH

Крім пеніцилінів та цефалоспоринів до  - лактамних антибіотиків відносяться цефаміцини (Streptomices).

На основі 6- АПК, було одержано більше 40000 напівсинтетичних пеніцилінів. У деяких випадках не було необхідності виділяти 6–АПК, шляхом гідролізу бензилпеніциліну, як при утворенні ампіциліну.

Гідроліз бензилпеніциліну здійснюють з участю мутанта Kluyvera citrophyla, після чого в ферментер вносять мутант Pseudomonas melanоgenum, і метиловий ефір DL-фенілгліцину. Умови процесу змінюють таким чином, щоб вони сприяли утворенню ампіциліну. У ролі каталізатора виступає ацилаза, утворена Pseudomonas melanоgenum, яка нездатна в цих умовах гідролізувати, або синтезувати бензилпеніцилін. Уворюється ампіцилін (амінобензилпеніцилін).

NH₂ NH₂

S СН₃

CH-COOH CH – CO – NH СН₃

6 АПК + ацилаза O=C N COOH

Ампіцилін

Інший шлях застосування ферментів в цій галузі – ферментативний синтез  - лактамних антибіотиків. Реакція гідролізу амідного зв’язку, яка проходить при цьому – обернена.

O O

 

R – C – NH – Q + H₂O R – C – OH + H₂N – Q, де Q - - лактамне кільце

Фермент каталізує пряму та обернену реакції. Водний розчин 6- АПК або 7-ДАЦК, а також відповідну кислоту, призводять в контакт з імобілізованою пеніцилінамідазою. Через деяких час в розчині встановлюється рівновага, утворюється певна кількість антибіотику. Основним недоліком є дуже низька швидкість реакції для більшості радикалів, причиною якого є висока специфічність фермента. Виділений фермент з E. сolli, з великою швидкістю перетворює субстрати з бічним ланцюгом, де є лише бензольна група, а де аміногрупа - в 10³ – 10⁴ раз повільніше. Необхідні ферменти з інших джерел, що мають іншу специфічність. Принцип прямої ферментації у присутності попередників, як при одержанні ампіциліну знаходить широке застосування при одержанні нових блеоміцинів, шляхом добавляння амінів в середовище культури Streptomices verticillus, і нових актиноміцинів, добавлянням 4 – метилпроліну до середовища для Streptomices parvules. При подавленні синтезу антибіотиків, також іноді утворюються корисні речовини, так наприклад при подавленні процесу приєднання молекули хлору Streptomices aurefociens утворює тетрациклін. Мутант Nocardia mediterranei, синтезує близько 20 різних рифаміцинів, серед яких препарати для лікування туберкульозу та прокази.

Глибоке вивчення механізмів дії ферментів, особливо тих, що інактивують антибіотики, дозволило налагодити виробництво стійких аналогів антибіотиків, таких як ампіцилін та карбеніцилін, а також знайти природні інгібітори лактамази – клавулонову і оліванову кислоти. Використовують  - лактамази для оцінки кількості пеніцилінів у харчових продуктах та біологічній сировині, а також, для інактивації пеніциліну в молоці, який може викликати алергічні реакції. Ці ферменти є частиною механізму детоксикації, з допомогою якого продуценти захищають себе від негативного впливу своїх продуктів життєдіяльності.

Проблема стійкості бактерій до дії  - лактамних антибіотиків пов’язана з дією мікробних ферментів  - лактамаз, це дало змогу підвищити антибактеріальну активність антибіотиків. Виявилось, що такий представник цефаміцинових антибіотиків, як клавулонова кислота, не лише проявляє антибактеріальні властивості, а й виявляє інгібіторну дію на бактеріальні  - лактамази.

О

С=СН – СН₂ – ОН

О=С N

Клавулонова кислота

Механізм дії -лактамаз заключається в гідролітичному розщепленні циклічного амідного зв’язку в  - лактамному кільці. А механізм дії  - лактамних антибіотиків до кінця не вивчений, але відомо, що він полягає у спорідненості їх з ферментами (транскриптази, карбоксипептидаза, ендопептидази), які беруть участь у синтезі пептидогліканової структури клітинної оболонки мікроорганізмів. Порушення процесу полімеризації пептидоглікану під дією антибіотиків веде до утворення дефектів, що перешкоджає життєдіяльності мікроорганізмів. Тому  - лактамні антибіотики відносять до найбільш токсичних антибактеріальних препаратів, і специфічних, тому що пептидоглікан відсутній у еукаріотів. Молекулярні механізми токсичної дії інших груп антибіотиків досягаються за рахунок порушення метаболізму в інших клітинних компонентах. Тож на основі клавулонової кислоти, і -лактамного антибіотика амоксициліну створені антибактеріальні препарати огментін (інгібітор  - лактамаз), та стрептоміцин. Створення нової біотехнології виробництва антибіотиків, основане на досягненнях молекулярної біології та генної інженерії. Шлях одержання більш ефективних штамів, оснований на невпорядкованих мутаціях став класичним (незважаючи на колосальні затрати праці та часу вчених ). Такий підхід є наслідком того, що антибіотик на відміну від білка не є продуктом вираження гену, тобто біосинтез його відбувається під дією 10-30 ферментів, кодованими різними генами. І зміна окремих генів не привела до успіху. Але розроблений метод генної інженерії, при якому в результаті певних дій, одержують мутацію виділеного з продуцента фрагменту ДНК, після чого цей фрагмент у складі векторів вводять в клітину. Генноінженерний підхід – це конструювання продуцентів з використанням плазмід в якості вектора для створення рекомбінованих ДНК, в які включені гени, що контролюють біосинтез антибіотиків. Але наявність в плазміді таких генів, встановлено лише у продуцентів метиленоміцину. В інших випадках плазмідам присвоюється роль регуляторів активності генів, які знаходяться в хромосомах. Передбачають, що плазміди знаходяться в деяких клітинах, і при несприятливих умовах швидко трансформують по всій популяції. Застосовують також прийоми клітинної інженерії – трансформацію протопластів з допомогою ліпосом, дію різних фізичних та хімічних факторів на протопласти. Застосовують різні мутації попередників, які при цьому втрачають фрагмент ДНК. Лімітує процес не лише фермент, а і недостатня кількість первинного метаболіту (генна інженерія), необхідно створити штам який продукує більшу кількість цього метаболіту. Також необхідно підвищити механізми захисту продуцента, від синтезованого ним антибіотика. Перспективною є ковалентна іммобілізація цілих клітин продуцентів.

Виробництво антибіотиків – сама більша галузь фармацевтики. Але їх застосування можливе не лише для терапевтичних цілей. Фітобактеріоміцин, трихотецин, використовуються для біологічного захисту рослин, від хвороб. Препарати тетрацикліну, бацитрацину, гризину, гігроміцину використовують в тваринництві для лікування і профілактики. Нізин і тетрациклін – добавки для концервацій. Монензин – стимулятор росту сільськогосподарських тварин. Фармакологічна дія заключається у пригніченні утворення метану в рубці жуйних метаногенними бактеріями. При цьому збільшується кількість летких кислот, особливо пропіонової, які засвоюються тваринами. Стрептоміцети (акверментини) – активні проти нематод, застосовуються для боротьби з гельмінтами домашніх тварин.

Вчені постійно шукають джерела нових антибіотиків (200-300 відкриттів кожного року), але рідко зустрічаються ті, застосування яких виправдовує себе в промисловості, поки що існуючі виробництва не мають аналогів.