Сlamydia pneumoniae.
Морфологические методы выявления (окраска микроскопических препаратов по Романовскому-Гимзе и т. п.) в настоящее время имеют лишь историческое значение.
Культуральные методы, основанные на заражении монослоя клеток материалом, полученным от больных, используются сегодня только в научных целях.
1. Серология. Определение специфических антител, образовавшихся в процессе иммунного ответа на микроорганизм (реакция связывания комплемента - РСК, реакция иммунофлюоресценции - РИФ, иммуноферментный анализ - ИФА, реакция микроиммунофлюоресценции - МИФ, радиоиммунный анализ - РИА и др.)
В настоящее время для диагностики хламидийной инфекции используют метод иммуноферментного анализа (ИФА), принцип которого основан на обнаружении специфических IgM-, IgA- и IgG-антител.
3. ПЦР.
4. Определение бактериальных антигенов (иммуноферментный анализ - ИФА); реакция прямой иммунофлюоресценции - ПИФ), ДНК-зонды.
Legionella pneumophila.
1. Бактериологический метод. Факультативный анаэроб, растёт на куриных эмбрионах, культурах клеток человека и обогащённых питательных средах (казеиново-угольный агар КУА, казеиново- дрожжевой агар, агар BCYE-α). Необходимыми факторами роста являются цистеин и железо. Не растёт на простых питательных средах. Оптимальная температура роста- 35-37*С, на искусственных питательных средах развивается медленно. Колонии округлые, выпуклые с лёгкой опалесценцией. Образует β-лактамазы, каталазу, вызывает гидролиз гиппурата.
Колонии L. pneumophila на BCYE-α агаре, отмечены стрелками.
Бактериологическое выделение и идентификация культуры L. pneumophila из клинического материала занимает не менее 5-7 дней.
Причем для получения клинического материала требуются инвазивные процедуры (бронхоскопия, биопсия), так как из мокроты, особенно после начала этиотропной терапии возбудитель удается выделить далеко не всегда.
2. Серологический метод.
При 4-кратном или более нарастании титра специфических антител к L. pneumophila серогруппа 1 в реакции непрямой иммунофлюоресценции.
3. Диагностика легионеллезной инфекции иммунохроматографическим методом.
Метод выявления антигена легионелл в клиническом материале является иммунохроматографическим тестом, он используется для
быстрого и достоверного подтверждения диагноза легионеллезной инфекции, вызванной L.pneumophila серогруппы 1. Растворимый
антиген выявляется в моче больных, начиная с третьего для болезни и может быть обнаружен в течение нескольких последующих месяцев (до 1 года).
Метод входит в международный стандарт (стандарт ВОЗ) диагностики легионеллеза и является базовым. В настоящее время в более чем 90% случаев окончательный диагноз внебольничной легионеллезной инфекции в мире устанавливается данным методом.
Метод основан на взаимодействии кроличьих антител к L.pneumophila серогруппа 1, нанесенных на нитроцеллюлозную мембрану с растворимым антигеном возбудителя, выявляемым в достаточно высокой концентрации во время заболевания в моче больного. Кроличьи антитела связаны с красителем, обеспечивающим визуализацию реакции в течение 15- 30 минут после нанесения образцов мочи на нитроцеллюлозную мембрану.
Проведение исследования
Для проведения теста тампон на палочке погружают в образец исследуемой мочи, вынимают и помещают в тест-устройство. Затем добавляют реагент А из прилагающейся пластиковой капельницы. Устройство закрывают с тем, чтобы привести исследуемый образец в контакт с тест-полоской.
Результаты учитываются спустя 15 минут и интерпретируются по наличию или отсутствию визуально различимых окрашенных линий от розового до пурпурного цвета.
Положительный результат включает выявление двух окрашенных линий в зоне чтения результата тестирования пациента, так и контрольной линии, в то время как отрицательный результат дает только одну окрашенную контрольную линию. Отсутствие окрашенной контрольной линии вне зависимости от наличия или отсутствия окрашенной линии в зоне чтения результата пациента, свидетельствует о недействительности теста.
4. Определение антител против LPS-антигена L. pneumophila с помощью ELISA отличается высокой специфичностью (99-100%) и более высокой чувствительностью, чем непрямой иммунофлуоресцентный анализ или микроагглютинация (агглютинация микроорганизмов, выявляемая лишь при микроскопии их взвеси).
Pneumocystis carinii.
Пневмоцистоз — протозойное заболевание, обусловленное Pneumocystis carinii, которая является одной из самых частых причин развития пневмоний у лиц с ослабленным иммунитетом. Возбудитель
— Pneumocystis carinii относится к типу простейших, подтип Sporozoa, класс Haplospora. Местом естественного обитания в нормальных условиях являются легкие.
1. Морфологический метод основан на прямом морфологическом выявлении пневмоцист в биологическом материале (легочной ткани, бронхо-альвеолярном лаваже (БАЛ), индуцированной мокроте (ИМ). Для
окраски препаратов с целью выявления Pneumocystis jiroveci используют
классические морфологические методы: импрегнация метенамин- серебряным нитратом по Гомори, окраска толуидиновым синим, гематоксилином и эозином, по Грамму и раствором Шиффа, а также методом Романовского-Гимза.
Толуидиновый синий/эозин.
Метод Ром-Гимза.
Импрегнация метенамин- серебряным нитратом по Гомори.
2. Серологические методы, выявляющие специфические антитела классов IgG и IgM (НРИФ и ИФА), также играют значительную роль в диагностике пневмоцистоза, особенно при эпидемиологических исследованиях или при диагностике, когда у больного невозможно взять лаважную жидкость или мокроту. Выявление 4-х кратного нарастания IgG и/или определение антител IgM против Pneumocystis jiroveci говорит об остром инфекционном процессе, вызванном этим возбудителем. Обнаружение антител к пневмоцисте у детей раннего возраста (до 1 года) имеет диагностическое значение.
3. Иммунофлюоресцентные методы для выявления цист и трофозоитов основаны как на использовании моноклональных, так и поликлональных антител.
Учет результатов начинают с оценки контролей. В положительных контрольных образцах (К+) должна наблюдаться яркая флюоресценция желто-зеленого цвета на 3-4 креста в клетках овальной или формы величиной от 2µ (трофозоиты) до 5-10µ (прецисты и цисты). В контроле с отрицательными контрольными образцами (К-) свечение должно отсутствовать или быть не более чем на один крест.