Фільтрація лікарських засобів, які не можуть бути простерилізовані у кінцевій первісній упаковці

Стерилізуюча фільтрація – це процес проходження потоку через фільтровальний матеріал, під час якого відбувається затримка організмів.ю в результаті чого поток рідини звільняється від забруднення.

Стерильний продукт – продукт, що не містить життєздатних мікроорганізмів, в тому числі патогенних.

Стерилізуюча фільтрація використовується лише для газів та рідин.

Стерилізація фільтрацією може бути виконана у вакуумних або герметичних умовах. Розрізняють гідрофільні, гідрофобні, багаторазового використання та одноразового (шприцеві) фільтри.

Принципи проведення стерилізуючої фільтрації.

 Система має бути максимально простою.

 Розміри системи повинні забезпечувати обмеження потоку пре фільтром перед стерилізуючою фільтрацією.

 Стерилізуючий фільтр повинен бути вмонтований у кінцеву точку системи.

 Краще використовувати тиск (не вакуум).

 Усі клапани поміщати перед фільтром.

 Не використовувати сполучень з різьбою.

 Проводити тест на цілісність системи до та після фільтрації.

 Промивати обладнання зразу після використання.

 Проводити фільтрацію у максимально чистих умовах..

 Стерилізуючи фільтри стерилізуються шляхом автоклавуванням у розібраному або повністю складеному стані на протязі 15 хвилин при 121 °С. Якщо необхідно, після автоклавування фільтр збирають в стерильних умовах ламінарного боксу.

Умови культивування виробничих штамів

Культивування є основною стадією технологічного процесу мікробного синтезу. Воно визначає кількісні та якісні характеристики виробництва біопрепаратів.

Під час культивування отримують біомасу та продукти метаболізму, які накопичуються у середині клітини та у культуральній рідині.

Ферментація – сукупність послідовних операцій від внесення у підготовлене середовище посівного матеріалу і до завершення процесу росту клітин або біосинтезу цільового продукта.

Культуральна рідина - складна суміш, яка утворюється після закінчення ферментації і складається з клітин продуценту, розчину невикористаних поживних компонентів і продуктів біосинтезу.

Культивування вимагає оптимізації таких параметрів:

 Температура (інтервал робочих Т коливається 25-60оС, точність до 1 оС);

 рН ( від 2до 9, з точністю до 0,2 рН);

 спосіб перемішування;

 концентрацію кисню для аеробів (розхід повітря від 0,15-до 2,5 м3 / м3 середовища /хв);

 стерильність;

 запобігання розповсюдженню мікроорганізмів-продуцентів у зовнішнє середовище;

 час культивування (для отримання біомаси -24 год, первинних метаболітів – 48-72 год, вторинних 72-144год); Як правило оптимальні умови культивування змінюються при кожному десятикратному збільшенні об‘єму біореактора.

Промислова ферментація процес багатоступеневий.

 Процедура розпочинається з виготовлення та стерилізації культурального середовища та обладнання.

 Спочатку вирощують висхідну культуру (5-10 мл).

 Потім інкубують її у колбі, яку струшують (200-1000мл).

 Після цього її переносять у ферментер для посівного матеріалу (10- 100л).

 Потім у промисловий ферментер (1000-100000 л).

 Збір матеріалу.

 Якщо продукт локалізований всередині клітини, останні руйнують та видаляють.

 Якщо продукт секретується, його виділяють безпосередньо з середовища.

ПРОМИСЛОВЕ КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

РОЗРІЗНЯЮТЬ:

1. ПОВЕРХНЕВЕ- вирощування промислової культури на середовищі, яке містить тверді частки субстрату. Культивування відбувається у кюветах, які виготовлені з оцинкованої жесті або нержавіючої сталі з перфорованим дном. Заповнені поживним середовищем кювети розміщують на етажерках з невеликим нахилом. Кювети об‘єднують у касети. Цей спосіб не є ефективним і використовується у разі відсутності альтернативного способу культивування. Використовується для отримання деяких ферментів з грибів-продуцентів, які культивуються на нестандартній сировині – відходах, наприклад, пшеничні висівки для отримання протеаз і амілаз, солодові паростки для отримання вітамінів та амінокислот. Поверхневе культивування буває:

 твердофазне – мікроорганізми ростуть на поверхні щільного середовища.

 Рідке – мікроорганізми ростуть на поверхні рідкого поживного середовища.

ГЛИБИННЕ – мікроорганізми розподіляються у всьому об‘ємі, а компоненти поживного середовища надходять в результаті аерації та перемішування. Це більш ефективний вид ферментації, дозволяє виробляти на одиницю часу та об‘єму більшу кількість цільового продукту.

За режимом культивування буває:

ПЕРІОДИЧНИМ – мікроорганізми вирощують у стерильних умовах без додавання свіжого культурального середовища. Періодичне культивування залежить від кінетичної кривої росту мікроорганізмів:

Лаг-фаза – клітини адаптуються до нових умов (рН, концентрація поживних речовин). Ця фаза спостерігається кожен раз, якщо посівний матеріал отриманий з культури у стаціонарну фазу. Тривалість лаг-фази залежить від часу знаходження у стаціонарній фазі і від відмінностей попереднього і нового середовища.

Якщо посівний матеріал отриманий від культури у експоненціальну фазу – ріст почнеться зразу без вираженої лаг-фази.

Експоненціальна фаза характеризується діленням клітин, при цьому питома швидкість росту залишається постійною.

В результаті виснаження лімітуючого субстрату або накопичення продуктів метаболізму, які пригнічують ріст, збільшення клітин припиняється і культура переходить у стаціонарну фазу. Біомаса залишається постійною, метаболізм змінюється. В цей період синтезуються вторинні метаболіти.

Фаза відмирання – енергетичні запаси закінчуються, метаболізм припиняється. Ферментацію зупиняють у стаціонарну фазу.

ПЕРІОДИЧНЕ КУЛЬТИВУВАННЯ З ДОДАВАННЯМ СУБСТРАТУ – до культури періодично додають поживні речовини, а культуральне середовище не видаляють до кінця культивування. У ферментер періодично додають субстрат, а кінцевий продукт збирають лише по завершенню культивування. Додавання субстрату призводить до подовження експоненціальної та стаціонарної фаз, а також до збільшення біомаси та кількості метаболітів.

У стаціонарну фазу мікроорганізми синтезують протеолітичні ферменти, які руйнують усі білки. Тому, якщо метою культивування є отримання білкових продуктів, треба зупинити ферментацію до цієї фази.

Періодичне культивування з додаванням субстрату можна використовувати для культивування клітин тварин та комах.

БЕЗПЕРЕРВНЕ КУЛЬТИВУВАННЯ – свіже культуральне середовище надходить у ферментер безперервно, паралельно відводиться така сама кількість клітинної суспензії.

Безперервна культура характеризується стаціонарними умовами – видалення клітин урівноважується їх збільшенням за рахунок поділу. Широке розповсюдження набули такі системи:

Хемостат - сталість хімічних характеристик та складу середовища, у якому знаходяться мікроорганізми Це процес, при якому у культуру з постійною швидкістю безперервно подається свіже поживне середовище, а об‘єм культури підтримується на постійному рівні шляхом безперервного видалення частини культуральної рідини. Базується на твердженні – абсолютна концентрація клітин не залежить від поживних речовин, які знаходяться у середовищі і лише від субстрату, якій лімітує ріст. Середовище складають так, щоб усі поживні компоненти були у надлишку у порівнянні з компонентами, які необхідні для синтезу клітини у необхідній концентрації. Цей єдиний компонент, якого не стає лімітує ріст та контролює величину мікробної популяції у сталому стані.

Турбидостат – це культивування де постійна концентрація мікроорганізмів підтримується шляхом регулювання оптичної щільності культури. У разі перевищення встановленого рівня вмикається насос, якій подає свіже середовище.

Cистема безперервного культивування поршневого типу – дозволяє імітувати періодичне культивування. Використовується лише у лабораторних умовах.

СТЕРИЛЬНЕ ТА НЕСТЕРИЛЬНЕ КУЛЬТИВУВАННЯ. Ідеальний варіант припускає 100% домінування виробничої культури. Однак, на практиці ця умова не виконується. Реально вдається забезпечити переважний ріст та життєздатність штаму-продуценту. Особливо це має значення на початку ферментації. У подальшому з‘являється стороння мікрофлора і завдання біотехнолога створити умови культивування, які б пригнічували ріст сторонньої мікрофлори. Це так звана нестерильна ферментація, яка насправді не існує, тому що створюються такі умови, які забезпечують домінування виробничого штаму над сторонньою мікрофлорою. Приклад - культивування у безперервних умовах кормових дріжджів, отримання оцтової кислоти при низьких рН, отримання кормового вітаміну В12 та анаеробне бродіння органічних речовин з використанням термофільних мікроорганізмів в температурних умовах 50- 55оС. також можна збільшити частку посівного матеріалу до 20-25%.

АЕРОБНЕ ТА АНАЕРОБНЕ КУЛЬТИВУВАННЯ. Під час аеробного культивування мікроорганізми потребують кисню у середовищі. Це досягається шляхом забезпечення необхідної концентрації розчиненого кисню у рідкому середовищі, шляхом надходження кисню по трубах (барботерах) з малими отворами по всій довжині. При цьому кисень 48 надходить у середовище у вигляді дрібних пухирців, які розчиняються під дією мішалки. Інколи використовують анаеробне культивування, наприклад для отримання вітаміну В12.

Визначення концентрації мікроорганізмів та клітин під час оптимізації процесів глибинного культивування у біореакторах можливе прямими та непрямими методами.