Зберігання та підтримування основних видів біотехнологічних обєктів

До ОБ’ЄКТІВ біотехнології відносять:

 віруси;

 мікроорганізми (прокаріоти, еукаріоти);

 макроорганізми;

 клітини та тканини рослин, тварин та людини;

 речовини біологічного походження (ферменти, нуклеїнові кислоти), молекули;

 генетично модифіковані організми

На сьогодні мікроорганізми використовуються у трьох видах біотехнологічного процесу:

 для отримання біомаси;

 для отримання продуктів метаболізму (наприклад, етанол, лимонна кислота, пеніцилін та ін.);

 для переробки сполук органічного (наприклад, відходи сільськогосподарського виробництва) та неорганічного походження (біодеградація сполук нафтового забруднення).

Основою будь-якого біотехнологічного виробництва є штам- продуцент цільового продукту.

Штам - клонована за походженням культура, спадкова однорідність якої підтримується відбором за специфічними ознаками.

Еталонний тест-штам — чиста культура мікроорганізму даного виду, яка має особливі фізіологічні, морфологічні та біохімічні властивості.

Штам – продуцент – це чиста культура мікроорганізму даного виду, яка за певних умов синтезує цінну для людини сполуку.

Вакцинний штам – це чиста культура мікроорганізму даного виду, яка має відмінні властивості від природних ізолятів збудників цього виду й є основою для виготовлення імунобіологічного препарату.

Виробничий штам - це чиста культура мікроорганізму даного виду, яка використовується для отримання цінної сполуки у загальній системі виробництва кінцевого цільового продукту.

Операції з живими біологічними агентами повинні бути належним чином ізольовані і відокремлені. Рівень ізоляції залежить від патогенності біологічного агенту, або якщо він класифікований як екзотичний.

Усі штами мікроорганізмів, токсини та отрути тваринного та рослинного походження поділяються за патогенною активністю на три групи:

І група – штами збудників ящуру (О, А, С, SAT, ASIA 1), везикулярного стоматиту, везикулярної хвороби свиней, чуми ВРХ, чуми ДРХ, інфекційної плевропневмонії ВРХ, лихоманки долини Рифт, катаральної лихоманки овець, КЧС, високо патогенного грипу птиці, хвороби Ньюкасла.

ІІ група – штами збудників сибірки, хвороби Ауєскі, лептоспірозу, сказу, лихоманки Ку, паратуберкульозу, бруцельозу ВРХ, ДРХ, туберкульозу ВРХ, лейкозу ВРХ, інфекційного ринотрахеїту, злоякісної катаральної гарячки, губкоподібної енцефалопатії, інфекційної плевропневмонії кіз, інфекційної агалактії, хламідіозу овець, сальмонельозу овець, скрепі,ензоотичного лімфангіту коней, інфекційного енцефаломієліту коней, ІНАН, грип коней, сап, японського та венесуельського енцефалітів, атрофічний риніт свиней, трансмісивний гастроентерит свиней, ентеровірусний енцефаломієліт, репродуктивно- респіраторний синдром, інфекційний бронхіт і ларинготрахеїт птиці, вірусний гепатит качок, вірусний ентерит качок, віспа курей, сальмонельоз курей, хвороба Гамборо, хвороба Марека; хвороб кролів – міксоматоз, вірусна геморагічна хвороба; хвороб риб - вірусна геморагічна септицемія, весняна віремія коропа; хвороб бджіл - американський та європейський гнилець; токсини Cl. botulinum, Cl. tetani.

ІІІ група – штами збудників брадзоту, ентеротоксемії, некробацильозу, псевдотуберкульозу, правця, вібріозу, пастерельозу, інфекційної агалактії овець та кіз; ентеровіруси, аденовіруси, трихофітії, мікроскопії, стафілококозів, стрептококозів, диплококозів та інші з невисоким ступенем патогенності.

Усі штами мікроорганізмів, що використовуються у виробництві імунобіологічних препаратів для ветеринарії в умовах вітчизняних підприємств зберігаються в депозитарії Державного науково-контрольного інституту біотехнології та штамів мікроорганізмів, в спеціальних лабораторіях (музеях) або колекціях живих культур збудників підприємств – виробників.

Музеї колекцій штамів мікроорганізмів забезпечують:

 колекціонування, підтримування та зберігання штамів мікроорганізмів, з якими дозволена робота в цих установах;

 облік усіх наявних штамів мікроорганізмів, токсинів та отрут;

 вивчення властивостей мікроорганізмів, що необхідні для паспортизації штамів, токсинів і отрут;

 контроль за зберіганням і використанням штамів мікроорганізмів у лабораторіях підприємства.

Для збереження штамів застосовують різні методи, що мають гарантувати збереження життєдіяльності та характерних властивостей мікроорганізмів.

Методи тривалого зберігання призначені для культури тривалого зберігання - це культура еталонного штаму в умовах тривалого зберігання.

Для тривалого зберігання застосовують:

 умови кріоконсервування - зберігання при температурі –40°С , – 70°С, –196°С у рідкому азоті з додаванням 10% глицерину на строк до 5 років (ефективний метод збереження вірусних еталонних штамів);

 умови середнього температурного режиму на строк зберігання 6 - 12 міс. Вирощену у напіврідкому середовищі (0,5% м‘ясопептонного агару або напівголодного, 0,4% м‘ясопептонного агару) у пробірках культуру заливають простерилізованою вазеліновою олією на висоту шару 1 см або на скошеному агаризованому середовищі при + 4°С – +8°С в холодильнику (для бактеріальних культур). В умовах сусло-агарового середовища в пробірках великого діаметру при температурі +4°С – +8°С для зберігання дріжджів. В умовах сусло-агарового, середовища Сабура або картопляно-глюкозного середовища в пробірках великого діаметру при температурі +4°С – +8°С для зберігання міцеліальних грибів.

 умови ліофілізації – зберігання еталонних штамів у герметично запаяних ампулах у ліофільно-висушеному стані зі збереженням життєздатності та характерних властивостей – строк зберігання до 5 років. На відміну від широко розповсюдженої методики ведення культур мікроорганізмів, заснованої на необмежених послідовних (лінійних) пересівах, дана схема ведення зводить до мінімуму кількість пасажів еталонної культури, проведених від моменту відновлення ліофілізованого матеріалу до цільового використання. Такий підхід дозволяє знизити ймовірність небажаних мутацій, що призводять до втрати еталонних властивостей штаму або випадкового забруднення. Забракована лінія еталонної культури може бути в будь-який момент замінена на нову. Цей метод дозволяє уникнути необхідності поповнювати запаси культури тимчасового зберігання за рахунок повторних пасажів еталонного штаму через поживні середовища і подовжує ―термін служби‖ культури, отриманої з однієї ампули.

Для тимчасового зберігання культуру еталонного штаму зберігають на відповідному середовищі при +4°С – +8°С - 1-3 місяці.

Пробірки та ампули із тест-штамами мікроорганізмів повинні мати чітке маркування, яке дозволяє ідентифікувати тест-штам, із зазначенням назви, номера тест-штаму мікроорганізму і дати його пересіву чи ліофілізації. Тест-штами мікроорганізмів слід зберігати відповідно до вимог у холодильнику (морозильній шафі) або у вогнетривкій шафі (сейфі) в контейнерах. Ззовні чи з середини шафи (сейфу) та холодильника розміщують список із переліком тест-штамів мікроорганізмів, що зберігаються.

Підтримання унікальних, виробничих та еталонних штамів мікроорганізмів здійснюють пасажуванням на чутливих моделях або на природно-сприйнятливих тваринах.

З метою зберігання чистоти унікальних виробничих і еталонних штамів мікроорганізмів і запобігання їх контамінації проводять пасажування штамів з дотриманням стерильності в умовах боксу. Одночасно в одному боксі можна пасажувати не більше одного штаму збудника хвороби. Кількість пасажів тестового мікроорганізму на поживних середовищах: з моменту його відновлення до моменту його цільового використання за можливості повинна бути мінімальною. Запаси еталонної культури не повинні поповнюватися за рахунок культури тимчасового зберігання. Контроль еталонного штаму на чистоту і відсутність дисоціації необхідно проводити перед закладанням на тривале зберігання і перед поповненням запасів культури тимчасового зберігання. Для цільового використання придатні культури еталонного штаму, що пройшли з моменту висіву із культури тимчасового зберігання не більше 5 пасажів.

Культура еталонного штаму, що пройшла не більше 5 пасажів після висіву з культури тимчасового зберігання та призначена для використання називається культура цільового використання.

З метою контролю зберігання властивостей штамами мікроорганізмів у музеях проводять періодичну перевірку їх відповідності паспортним даним.

Паспорт штаму – мікроорганізму (вірусу) – офіційний документ, що містить повну назву штаму, відомості про походження, коротку характеристику морфологічних, біохімічних та культуральних властивостей штаму, призначення тест-штаму, умови підтримування та культивування.

Відомості про всі штами мікроорганізмів, які надійшли в музеї та їх рух підлягають реєстрації в спеціально прошнурованих і пронумерованих книгах, скріплених печаткою і підписом керівника установи.

З цією метою у лабораторіях, що зберігають штами мікроорганізмів необхідно вести такі документи: журнал обліку надходження штамів мікроорганізмів; інвентарна книга виробничих і контрольних штамів мікроорганізмів; журнал обліку руху виробничих або контрольних штамів; книга обліку зараження тварин; книга обліку виділених культур і їх знищення; книга записів результатів перевірки властивостей виробничих або музейних штамів вірусів, бактерій, грибів, токсинів і отрут тваринного походження; паспорт.