Вимоги до основних видів субстратів.

Культивування є важливою стадією збереження, підтримування, напрацювання біомаси та синтезу цінних метаболітів штамами – продуцентами.

Культивування(ферментація)- це сукупність послідовних операцій, від внесення у підготовлене середовище посівного матеріалу і до завершення процесу росту клітин або біосинтезу цільового продукта.

Будь-який біотехнологічний об‘єкт потребує поживного середовища, до складу якого входить субстрат, який є джерелом вуглецю та енергії, забезпечує нормальний розвиток та біосинтетичну активність об’єкта.

Будь-яке поживне середовище повинно відповідати наступним вимогам:

 містити усі необхідні для росту та розмноження мікроорганізму речовини;

 мати достатню вологість;

 відповідне рН, Еh;

 усі середовища повинні бути максимально уніфікованими.

За складом середовища поділяють на:

 культуральне середовище з хімічно визначеним складом – так зване синтетичне поживне середовище, що складається з хімічно визначених інгредієнтів (з відомою молекулярною структурою та ступенем чистоти);

 культуральне середовище з неповністю охарактеризованим хімічним складом – середовище, що складається повністю або частково з природних матеріалів, оброблених або незмінних, хімічний склад яких визначений неповністю (з природних продуктів тваринного та рослинного походження, з різних екстрактів, бульйонів та відварів з додаванням неорганічних солей, вуглеводів та азотистих речовин).

Мікроорганізми, що нездатні синтезувати усі органічні сполуки, необхідні для їх росту та розмноження (вітаміни, амінокислоти, 22 нуклеотиди) називаються ауксотрофними та потребують внесення у середовище факторів росту

За консистенцією середовища бувають:

 рідкі – для вивчення фізіолого-біохімічних властивостей штамів-мікроорганізмів, для накопичення біомаси та продуктів біосинтезу;

 напіврідкі – для тривалого збереження штамів-мікроорганізмів;

 щільні – для виділення чистих культур, вивчення морфології колоній, кількісного обліку, визначення антагоністичних властивостей, селекційного відбору;

 сипучі середовища – використовують для зберігання посівного матеріалу культур продуцентів. До них відносять розварене пшоно, активоване вугілля, кварцовий пісок, просочений поживним розчином.

За призначенням середовища поділяють на:

 звичайні – для культивування більшості мікроорганізмів (як приклад, МПА, МПБ);

 спеціальні – для виділення та культивування певних груп та видів штамів- мікроорганізмів;

 елективне – селективне середовище збагачення, що підтримує розмноження певних видів мікроорганізмів, частково або повністю пригнічуючи ріст інших мікроорганізмів (для виділення певного виду з місць його природного накопичення). (наприклад, середовище Раппапорта- Василиадиса (Rappaport-Vassiliadis).

 диференційно-діагностичні – для вивчення біохімічних властивостей та для диференціації штамів за ферментативною активністю.

Також за призначенням середовища розрізняють:

 Середовища для транспортування – культуральне середовище, призначене для збереження та підтримування життєздатності мікроорганізмів з моменту їх відбору до початку аналізу у лабораторії. Такі середовища, як правило містять такі речовини, що не допускають розмноження мікроорганізмів, але гарантують їх збереження (наприклад, транспортне середовище Стюарта або Еймса).

 Середовища для збереження мікроорганізмів – культуральне середовище, призначене для збереження та підтримування життєздатності мікроорганізмів протягом тривалого періоду, щоб захистити їх від несприятливих факторів та дозволити відновити ріст мікроорганізму після цього періоду (наприклад, яєчне середовище Дорсе);

 Середовище для відновлення – культуральне середовище, що дозволяє мікроорганізмам, які знаходяться у стані стресу або ослаблення, відновлювати здатність до нормального росту без обов‘язкових умов до їх розмноження.

 Середовище збагачення – культуральне середовище, що забезпечує особливо сприйнятливі умови для розмноження мікроорганізмів.

 Культуральні середовища, що мають багатоцільове використання – культуральні середовища, що можуть відноситися до деяких категорій одночасно, наприклад кров‘яний агар є середовищем відновлення, виділення та диференційним, для визначення гемолізу.

ОСНОВИ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ. До складу поживних середовищ входять різні компоненти: пептон (джерело азоту), вуглеводи (джерело вуглецю), мінеральні речовини (неорганічні солі), селективні речовини, вітаміни, фарбники та індикатори рН, гелеутворюючі компоненти.

1. Пептони (м’ясний, казеїновий, соєвий, желатиновий, дріжджовий та ін.) - продукти гідролізу білка, що являють собою суміш поліпептидів, олігопептидів, амінокислот, органічних джерел азоту, солей та мікроелементів. Характеристика пептону залежить від джерела білка та типу гідролізу (кислотного чи ферментативного). Гідролізати з високим ступенем розщеплення білка використовують для вирощування найбільш вимогливих до поживних середовищ мікроорганізмів. Гідролізати з низьким ступенем розщеплення використовують для вирощування більшості патогенних бактерій та для культивування вакцинних штамів.

Гідролізати крові краще використовувати для культивування гемофільних мікроорганізмів, а гідролізати молока – для молочнокислих бактерій.

Для контролю пептонів використовують наступні тести:

 Ступінь перетравлювання;

 Вміст азоту;

 Втрати при 100оС;

 Вміст амінного азоту;

 Зольність;

 Відсутність нітритів;

 Вміст солей (NaCl);

 Вміст фосфатів;

 Мікроелементи;

 Вуглеводи, що ферментуються;

 Ліпіди;

 Вітаміни;

 Сумісність з іншими інгредієнтами при 121 оС - 15 хв.;

 Культуральні та біохімічні властивості тест-культур (утворення індолу, сірководню, ацетилметилкарбінолу).

2. Вуглеводи. До складу поживних середовищ здебільшого входять наступні вуглеводи: адоніт, інулін, саліцин, арабіноза, крохмаль, сахароза, галактоза, ксілоза, сорбіт, глікоген, лактоза, трегалоза, гліцерин, мальтоза, фруктоза, глюкоза, манніт, целлобіоза, декстрин, манноза, еритрит, дульцит, рамноза, ескулін, інозит, раффіноза.

Вуглеводи, що використовуються у поживних середовищах, перевіряють на відсутність домішок. Контроль істинності вуглеводу перевіряють, готуючи рідкі та щільні поживні середовища з відомим вуглеводом – стандартним та тим, що досліджується. Перевіряють здатність вуглеводів підтримувати ріст мікроорганізмів. На щільних середовищах після культивування порівнюють характеристики колоній на стандартному середовищі та тому, що досліджується.

3. Мінеральні речовини. Мінеральні солі необхідні для росту та метаболізму усіх живих клітин. Для більшості бактерій необхідно наявність у поживному середовищі Na, K, Mg, Fe2+, 3+.

4. Селективні речовини (солі жовчних кислот та бичача жовч). Речовини, що отримують з жовчі, вводять до складу поживних середовищ для диференціації бактерій, адаптованих та неадаптованих до умов кишечнику. Для диференціації бактерій за толерантністю до жовчі готують селективні середовища з підвищеною концентрацією жовчі та її похідних. У середовищі ці речовини не повинні впливати на первинний колір індикатора та його подальші зміни у процесі росту мікроорганізмів. Щільні поживні середовища з різними солями жовчі перевіряються методом поверхневої краплі за Miles та Misra.

5. Фарбники та індикатори. Фарбники, що додаються у середовища використовують як селективні речовини, а також як індикатори рН та окисно-відновного потенціалу. Їх інгібуючи активність залежить від взаємодії з іншими компонентами середовища. Так, активність бріліантового зеленого по відношенню до E. coli суттєво варіює у розчинах різних пептонів. З бріліантовим зеленим взаємодіють солі жовчі, в результаті чого знижується токсичність фарби, що необхідно враховувати під час конструювання середовищ. Анілінові фарбники більш токсичні у стані повного окислення, а під час їх стерилізації у присутності пептону можливе їх часткове відновлення. Також під час використання агару з високим вмістом мінеральних речовин часто спостерігається несумісність компонентів середовища. Окрім контролю хімічної чистоти фарбник повинен бути перевірений мікробіологічним методом, шляхом висіву референт-штаму у середовище зі стандартним та досліджуваним фарбником.

Індикатори вводять у поживні середовища для визначення змін рН середовищ під час росту мікроорганізмів та контролі Еh. Наприклад, феноловий червоний у діапазоні рН 6,8-8,4 змінює колір середовища від жовтого до червоного, бромтимоловий синій у діапазоні рН 6,0-7,6 з жовтого на синій, а фенолфталеїн у діапазоні рН 8,3-10,0 з безкольорового на червоний.

6. Гелеутворювачі. Для конструювання щільних середовищ у якості ущільнювача використовують агар, продукт екстракції червоних та бурих водоростей. Основний компонент агару – кальцієва сіль ефіру сірчаної кислоти та поліцукру агарози. Більшість мікроорганізмів не розщеплює агар – він є інертним компонентом поживного середовища.

КОНСТРУЮВАННЯ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ.

Для культивування мікроорганізмів на даний час використовують «нестандартні поживні середовища», які необхідно контролювати за вмістом загального та амінного азоту та рН.

Для конструювання поживних середовищ необхідно дотримуватися наступних принципів:

 задоволення поживних потреб мікроорганізмів;

 вибір джерел сировини для конструювання середовищ;

 диференціація поживних середовищ за цільовим призначенням;

 оптимізація поживних середовищ;

 стандартизація поживних середовищ.

Якість поживного середовища контролюють за такими параметрами:

 колір;

 запах;

 вологість;

 розчинність;

 прозорість;

 гелеутворення;

 температура плавлення;

 рН;

 еH;

 ростові якості середовища визначають для відповідних типових культур тест- мікроорганізмів за показниками:

 швидкість росту;

 чутливість;

 кількість біомаси;

 які мікроорганізми ростуть на середовищі;

 мікроорганізми, ріст яких пригнічується;

 характеристика колоній на середовищі;

 стабільність збереження основних властивостей мікроорганізмів.

Швидкість росту визначається кривою росту та дозволяє оцінити стандартність середовищ та їх компонентів й характеризує середовища як:

 середовище з коротким лаг-періодом для швидкого росту невеликої висхідної кількості клітин (для визначення стерильності, для отримання посівного матеріалу для ферментації і ін.);

 середовище, що забезпечує максимальну кількість клітин, може бути використана для отримання біомаси під час виготовлення вакцин.

Чутливість визначається за мінімальним числом колонієутворюючих одиниц (КУО) під час посіву мікробної завісі заданої концентрації, при якому спостерігається ріст на усіх засіяних чашках.

Стабільність збереження основних властивостей мікроорганізмів оцінюють шляхом вивчення характерних для певного виду морфологічних та фізіологічних ознак під час росту на середовищі, яке контролюється.

Культивування м.о розпочинається з лаг-фази, під час якої клітини адаптуються до певних умов.

Експоненціальна фаза(фаза логарифмічного росту)- характеризується інтенсивними діленням мікробних клітин, при цьому питома швидкість росту залишається постійною.

В результаті виснаження лімітуючого субстрату або накопичення продуктів метаболізму, які пригнічують ріст, збільшення клітин припиняється й культура переходить у стаціонарну фазу.

Фаза старіння та відмирання мікробної культури характеризується закінченням енергетичних запасів культуральної рідини та припиненням клітинного метаболізму. Процес культивування(ферментації) потрібно зупинити до настання цієї фази.