Селекція штамів для створення суперпродуцентів та вакцинних штамів.

Шляхом простого підбору отримати високоактивні продуценти не вдається, тому стратегія селекційної роботи з мікроорганізмами полягає у пошуку природних форм, які володіють корисними якостями для людини (синтез цінної сполуки, висока швидкість росту, здатність до засвоєння дешевих та доступних матеріалів) та створенню на їх базі промислових штамів. Це відбувається шляхом зміни регуляції метаболічної активності мікробної клітини.

Методи сучасної селекції – це сукупність маніпуляцій, за допомогою яких змінюють генетичну програму мікроорганізмів.

Генетичне конструювання in vivo – отримання та виділення мутантів з використанням різних способів обміну спадковою інформацією живих мікробних клітин.

Генетичне конструювання in vitro базується на використанні генетичної інженерії (створення рекомбінантних ДНК). Проте, цей поділ умовний, тому що методи взаємопов‘язані.

Клон - (від грец. klon – гілка нащадків) – популяція клітин або організмів, що походять від загального предка шляхом безстатевого розмноження.

Коли неможливо провести прямий відбір мутантів, досліджують колонії на індикаторних чашках, застосовують тест-культури мікроорганізмів, метод відбитків (реплік). За необхідністю вирощують кожну окрему колонію та визначають у культуральній рідині активність синтезованої речовини.

Метод індикаторних чашок полягає у вирощуванні окремих колоній у чашках з середовищем з індикатором, якій виявляє різницю рН між колоніями, які метаболізують або ні певні вуглеводи. Мутанти різняться за коліром колоній та фенотипом (на агарі з трифенілтетразолієм колонії, які не зброджують лактозу, набувають червоного коліру, а колонії які зброджують залишаються незафарбованими). Інколи вносять субстрати, які змінюють прозорість середовищ – навколо колоній мутантів утворюються прозорі зони.

Метод тест-культур вимагає використання ауксотрофів та чутливих до антибіотиків культур. Характеристику мутантів проводять за зоною росту або пригнічення, а також структурою, формою та прозорістю колоній. Отримання та вдосконалення штамів-продуцентів амінокислот вимагає перевірки великої кількості мутантів. Ефективність селекції тим вища, чим більший об‘єм матеріалу, що піддається відбору. Між тим під час «відбору у ручну», коли виділяються окремі колонії та перевіряються в умовах ферментації в колбах на гойдалках, вірогідність находження високоактивних штамів обмежується кількістю матеріалу. Тому попередня оцінка активності штамів-продуцентів амінокислот дозволяє виключити заздалегідь безперспективні мутанти, і відповідно, скоротити кількість варіантів, що потребують кінцевої перевірки

Принцип дії методу тест-культур базується на явищі синтрофізму, коли під час сумісного висіву на мінімальне поживне середовище навколо колоній продуцентів утворюються зони росту мікробів, які потребують відповідні амінокислоти. Розмір зон знаходиться у прямій залежності від кількості амінокислоти, що синтезується. Колонії, що утворюють найбільші зони, використовують для подальших перевірок за допомогою більш складних та точних способів оцінки - ферментацією у колбах та ферментерах. Для використання цього методу у селекції штамів- продуцентів амінокислот необхідною умовою є наявність відповідних тест-культур, ауксотроф них за певними амінокислотами.

Метод відбитків, запропонований Ледерберг Д, Ледерберг Е, 1952р.

Сутність методу полягає у відборі мутантів, що здатні рости на різних середовищах:

1. Чашки Петрі із звичайним середовищем засівають культурою мікроорганізму, таким чином щоб на ній виросло 50-200 колоній.

2. Стерильний оксамит або фільтровальний папір натягують на металевий циліндр з діаметром, що відповідає чашці Петрі, та закріплюють. Чашки з колоніями прикладають до поверхні оксамиту.

3. Потім до цього оксамиту з відбитками колоній прикладають чисті чашки з різними середовищами.

4. Після культивування на них утворюються колонії у аналогічному розташуванні. На чашках з мінімальними середовищами можна виявити ауксотрофні мутанти. Різні модифікації цього метода використовуються для виділення мутантів з поживними потребами, а також мутантів чутливих до фізичних, хімічних та біологічних факторів (температура, фаги, антибіотики).

Міцеліальні гриби для виділення ауксотрофних мутантів використовують метод збагачення при фільтруванні. Під час культивування на мінімальних середовищах прототрофні клітини поділяються та утворюють великі частки, які затримуються фільтром, а клітини, які не діляться промиваються у фільтрат.

Досягнення молекулярної генетики дозволили проводити відбір продуцентів за стійкістю їх до структурних аналогів цільового продукту. Метод базується на регуляції ферментів за принципом зворотного зв‘язку кінцевого продукту біосинтетичного шляху. Підвищення концентрації метаболіту інгибує активність ферменту, який приймає участь у синтезі метаболіту, або репресує синтез цього ферменту.

Мутант ауксотрофен - росте лише при додаванні у середовище культивування речовини, яка є продуктом блокованої реакції.