1. Наявність декількох сайтів для клонування
2. Можливість простої ідентифікації клітин з рекомбінантними днк
Для усіх рутинних процедур молекулярного клонування широко використовуютьE.coli, але також часто у якості господарів використовують Bacillus subtilis,Agrobacterium tumefaciens.
Особливості клонування структурних генів еукаріот:
Ø Прокаріоти не можуть видаляти інтрони з первинних РНК-транскриптів, тому правильна трансляція еукаріотичної мРНК у бактеріальній клітині не можлива
Ø Експресія еукаріотичної ДНК може відбуватися лише за наявності прокаріотичних сигнальних послідовностей, які регулюють транскрипцію та трансляцію
Різні кДНК можна вбудовувати у плазмідний вектор.
Вектори для клонування великих фрагментів ДНК.
Вектори на основі бактеріофагу λ.
За допомогою плазмідних векторів можна клонувати фрагменти ДНК довжиною до 10 т.п.н. Проте інколи треба працювати з великими фрагментами ДНК. Для цього були розроблені вектори на основі бактеріофага λ.
Клонуюча система на основі бактеріофагу
Фагова ДНК має два BamHI-сайта, фланкуючих І/Е-сегмент (інтеграції та виключення).
Клонувальну ДНК розщеплюють за допомогою BamHI, відбирають сегменти розміром 15-20 т.п.н.
Фагову ДНК розщеплюють за допомогою BamHI. Під час гідролізу очищеної фагової ДНК рестриктазою утворюються три фрагмента:
· ліве плече (L)-містить інформацію про головку та хвіст
· Праве плече (R) відповідає за реплікацію ДНК та лізис
· Середній фрагмент- несе гени, які відповідають за процеси інтеграції та виключення.
Завдання – замінити цей центральний сегмент необхідною послідовністю ДНК.
Обидва препарати змішують та обробляють ДНК-лігазою фага Т4.
У результаті змішування отримують:
· Відновлену ДНК фага λ.
· Рекомбінантні молекули, які містять R і L-ділянки фагової ДНК та вставку клонованої ДНК розміром до 20 т.п.н., яка займає місто І/Е-сегмента.
Рекомбінантні молекули довжиною 50 т.п.н. упаковують у пусті головки бактеріофага in vitro, додають відростки та отримують інфекційні фагові частки. Фрагменти більше 52 та менше 38 т.п.н. упаковуватися не можуть.
Рекомбінантний фаг може розмножуватися лише у штамах E.coli, які не забезпечують розмноження фага з інтактним І/Е-сегментом.
Косміди
Вектори, які можуть включати до 40 т.п.н. чужорідної ДНК та активно ампліфікуватися у E.coli як плазміди називаються косміди. Косміди об’єднують властивості плазмідних векторів та векторів на основі фагів.
Косміда (pLFR-5) має два соs-сайта, які розділені сайтом рестрикції для ScaI,полілінкер з шістьома унікальними сайтами рестрикції, точку початку реплікації (ori) та ген стійкості до тетрацикліну.
повернутися до змісту
