Лекція № 4. Генетична інженерія. Технології рекомбінантних днк

БІОТЕХНОЛОГІЯ У ВЕТЕРИНАРНІЙ МЕДИЦИНІ

Ветеринарна медицина.

Факультет ветеринарної медицини.

Кафедра мікробіології, вірусології та біотехнології.

ТЕМА ЛЕКЦІЇ: ГЕНЕТИЧНА ІНЖЕНЕРІЯ.

ТЕХНОЛОГІЇ РЕКОМБІНАНТНИХ ДНК

Автор: новіцька о.В., кандидат ветеринарних наук анотація

Викладено інформацію щодо сукупності експериментальних процедур, які дозволяють проводити перенесення генетичного матеріалу (ДНК) з одного організму у другий.

Метою вивчення лекційного матеріалу є засвоєння теоретичних основ методики конструювання рекомбінантних ДНК.

План лекції:

І. Технологія рекомбінантних ДНК

a. схема отримання рекомбінантних днк

b. ферменти, які використовують у генній інженерії

c. утворення липких та тупих кінців

d. картування сайтів рестрикції

ІІ. Вектори

a. вимоги до векторів

b. трансформація та відбір клітин-донорів

c. ідентифікація клітин з рекомбінантною ДНК

ЗМІСТ ЛЕКЦІЇ

І. ТЕХНОЛОГІЯ РЕКОМБІНАНТНИХ ДНК

Технологія рекомбінантних ДНК (молекулярне клонування, генна інженерія) – сукупність експериментальних процедур, які дозволяють проводити перенесення генетичного матеріалу (ДНК) з одного організму у другий.

Гена інженерія це конструювання in vitro функціонально активних генетичних структур тобто створення штучно генетичних програм.

Основне завдання прикладної генної інженерії – конструювання рекомбінантних ДНК, які можуть надати клітинам-реципієнтам здатність до синтезу таких речовин як гормони, інсулін, соматотропні, інтерферон, урокіназу та ін.

Створенню методики рекомбінантних ДНК передували відкриття у галузях молекулярної біології, ензимології нуклеїнових кислот, молекулярної генетиці вірусів та поза хромосомних елементів бактерій (бактерій).

Формально датою народження генної інженерії можна вважати 1972 рік, коли амеріканці Герберт Бойер, Пол Берг і Стенлі Коен запропонували новаторський підхід об’єднання біохімії з технологіями, вони розробили рекомбінантну ДНК, яка поєднала ДНК людини та бактерії. Вчені винайшли спосіб перетворення бактерій у «фабрики» по виготовленню таких важливих для людини білків як інсулін та гормон росту.

Приблизна схема отримання рекомбінантних днк:

1. З організму донора екстрагують нативну ДНК, з наступним ферментативним гідролізом (розрізають) та з’єднують (лігують) з іншою ДНК (клоную чим вектором), в результаті чого отримують рекомбінантну молекулу (конструкція «вектор-ДНК»).

2. Цю конструкцію вводять у клітину-господаря (реціпієнт), там вона реп лікується та передається нащадкам. Цей процес називається трансформацією.

3. Ідентифікація та відбір клітин, які несуть рекомбінантну ДНК.

4. Синтез клітинами-господарями специфічного білкового продукту, що є підтвердженням клонування необхідного гена .

Конструювання рекомбінантних молекул можливо лише за умов використання великої кількості ферментів, які є обов’язковими та незамінними інструментами у процесі отримання рекомбінантних ДНК.

Ферменти, які використовують у генній інженерії.

Для клонування важливо отримати окремі специфічні ділянки (сайти) донорної та векторної ДНК.

Якщо пропустити хромосомну ДНК через шприц з голкою малого діаметру або обробити ультразвуком, ми можемо отримати фрагменти від 0,3- до 5 т.п.н. Нажаль, розриви під час таких маніпуляцій виникають випадково і не повторюються при наступній обробці.

Отримати специфічні ділянки ДНК стало можливо після виділення ферментів, які впізнають певні послідовності основ у дволанцюговій молекулі ДНК і розщеплюють обидва ланцюги. Ці ферменти називаються рестрикуючи ендонуклеази типа ІІ.

Перша рестриктаза була виділена у 1968 році Мезельсоном і Юанем.

Одна з перших ендонуклеаз рестрикції типа ІІ була виділена з бактерії Escherichia coliта отримала назву EcoRI.

Цей фермент впізнає ділянку ДНК, яка містить специфічну паліндромну послідовність (послідовність-перевертень, яка однаково читається у напрямку 5-3) з 6 пар основ та вносить розрив між залишками гуаніна та аденіна. При цьому розщеплюється зв'язок між атомом кисню при 3-атомі вуглецю цукрового залишку одного нуклеотиду та фосфатною групою, приєднаною до 5-вуглецевого атому цукрового залишку сусіднього нуклеотиду. Розриви у ланцюгу відбуваються таким чином, що утворюються так звані «липки кінці».

«Липкий кінець» - вільний одноланцюговий кінець дволанцюгової ДНК,комплементарний одно ланцюговому кінцю, що належить цій самій або іншій молекулі ДНК.

Є такі ендонуклеази, які розщеплюють ланцюги строго один напроти одного тоді утворюються фрагменти ДНК з «тупими кінцями».

Кожен одноланцюговий хвіст закінчується 5-фосфатною групою, а 3- гідроксильна група протилежного ланцюга ніби втоплена.Отримано біля сотні ендонуклеаз рестрикції типу ІІ. Назви для них складаються з літер роду та виду. Римськи цифри – номер ендонуклеази, яку виділили з мікроорганізму.

Наприклад:

Escherichia coli - EcoRI.

Haemophilus parainfluenzae – HpaI, HpaII

Паліндромні послідовності, які розпізнаються ендонуклеазами рестрикції типа ІІ і в яких виникає розщеплення називаються «сайтами впізнання».

Сайти впізнання можуть складатися з 4, 5, 6, 8 та більше пар нуклеотидів. Від довжини «сайта впізнання» залежить частота його розповсюдження у молекулі ДНК.

ферменти	Сайт впізнання	Характер розщеплення
EcoR I	G AATTC CTTAA G	Липкі кінці
BamH I	G GATCC CCTAG G	Липкі кінці
Pst I	CTGCA G G ACGTC	Липкі кінці
Sau3A I	GATC CTAG	Липкі кінці
Pvu II	CAG CTG GTC GAC	Тупі кінці
Hpa I	GTT AAC CAA TTG	Тупі кінці
Hae III	GG CC CC GG	Тупі кінці

Якщо неодноразово обробляти зразок ДНК певною рестриктазою (при умові, що розщеплення проходить по всім сайтам рестрикції) тоді утворюється один і той самий набір фрагментів. Якщо використовувати декілька ферментів рестрикції окремо, а потім обробити ДНК комбінаціями, можна побудувати фізичну карту рестрикції (послідовність сайтів рестрикції). Визначив розмір отриманих фрагментів за допомогою гель-електрофорезу, можна знайти положення рестрикційних сайтів.

Проте для молекулярного клонування одних ферментів рестрикції недостатньо:

v Водневий зв'язок між чотирма основа, які утворюють липкі кінці слабкий і не може утримати два фрагмента ДНК, які об’єдналися. Тому використовують фермент ДНК –лігазу бактеріофагу Т4. Він каталізує утворення фосфодиефірних зв’язків (відновлює зв'язок між 3-гідроксильною групою одного ланцюга та 5-фосфатною групою другого ланцюга) між кінцями полінуклеотидних ланцюгів, які утримуються між собою завдяки спарюванню липких кінців.

Також ДНК-лігаза Т4 зшиває тупі кінці, які наближаються, коли об’єднані фрагменти зв’язуються з ферментом.

v Об’єднання різних молекул ДНК не має сенсу, якщо утворенні рекомбінантні ДНК не будуть реплікуватися у клітині-господарі.

v Під час рестрикції ДНК утворюється суміш різних фрагментів, які після лігування з векторною ДНК утворюють багато комбінацій. Для їх розпізнання застосовують різні системи скринінгу.

повернутися до змісту