Іі. Вектори

Вектор – молекула ДНК, що має здатність до автономної реплікації в клітині-хазяїні, в яку можна ввести додатковий фрагмент чужорідної ЖНК і забезпечити його реплікацію.

Плазміди- це поза хромосомні дволанцюгові кільцеві молекули ДНК, які реплікуються автономно.

Плазміди мають розміри від 1 до 500 т.п.н. Кожна з них несе сайт ініціації реплікації(ori), без якого плазміда не зможе реплікуватися у клітині.

Всього плазмідної ДНК 0,1-5,0% сумарної клітинної ДНК.

Якщо дві та більше плазмід не можуть існувати у одній клітині тоді вони належать до одної групи несумісності. Плазміди різних груп несумісності безперешкодно існують у одній клітині.

Вимоги до векторів:

v Невеликий розмір (ефективність перенесення екзогенної ДНК у E.coli знижується при довжині плазміди більше 15 т.п.н.).

v Наявність унікального сайту рестрикції, в якій можна вставити екзогенну ДНК.

v Наявність селективних генетичних маркерів для ідентифікації реципієнт них клітин, які несуть рекомбінантну ДНК.

Тому плазмідні вектори створюють за допомогою генної інженерії.

Плазмідний вектор pBR322 був одним з найпопулярніших векторів 80 років 20 ст. Цю плазміду створили Ф.Болівар та Р.Родригес. Довжина плазміди 4361 п.н.

Вона несе два гена стійкості до антибіотиків – ампіциліну та тетрацикліну, а також унікальні сайти для BamHI, HindIII, SalI в гене Tet^r, один сайт PstI в гені Amp^r, один сайт для EcoRI. Також є сигнал початку реплікації виключно у ешеріхії. В інші бактерійні клітини переноситься важко.

Як працює клонуючий вектор?

Плазміду обробляють рестриктазою, яка розщепляє кільце плазміди лише в одному сайті одного з генів стійкості. Таким чином утворюється лінійна молекула з липкими кінцями.

Такі молекули змішують з попередньо обробленою рестриктазами донорною ДНК (яка містить необхідний ген). Така ДНК теж має липкі кінці.

Оскільки липкі кінці цих двох ДНК комплементарні, вони спарюються з утворенням гібридних молекул.

Потім суміш обробляють ДНК-лігазою фага Т4 у присутності АТР.

В результаті утворюються

· різні комбінації фрагментів

· об’єднані фрагменти донорної ДНК

· об’єднані фрагменти плазмідної ДНК

Щоб зменшити кількість об’єднаних фрагментів плазмідної ДНК, рестрикційну ДНК обробляють лужною фосфатазою, яка відщеплює від лінеарізованої молекули ДНК 5-фосфатні групи. ДНК-лігаза не може зшити дефосфорильовані кінці плазмідної ДНК.

Рекомбінантні молекули ДНК мають два одно ланцюгових розриву, проте її фрагменти тримаються разом двома фосфордиефірними зв’язками, які утворюються між дефосфорильованою плазмідною ДНК та рестрикованою донорною ДНК. Після реплікації у трансформованій клітині одноланцюгові розриви лігуються системою клітини-господаря (рис. 26).

Трансформація та відбір.

Щоб створити копії рекомбінантних ДНК необхідно ввести її у клітину-господаря. Цей процес називається трансформацією.

Практично трансформація досягається змішуванням клітин-хазяїв та суміші ДНК. Для досягнення більшої ефективності клітини піддають дії високих температур, обробляють CaCl₂. Проте ефективність трансформації залишається невисокою, як правило трансформації піддаються одна з тисячі клітин.

Більшість клітин не містять рекомбінантні ДНК. В деяких з них є об’єднана плазмідна ДНК, в інших неплазмідна ДНК, і лише в поодиноких гібридомна плазміда.

Потім необхідно провести ідентифікацію клітин, які містять рекомбінантну ДНК.

Ідентифікація складається з двох етапів. Клітини після трансформації висівають на поживні середовища з ампіциліном – виростають клітини з інтактним геном Amp^r або у складі плазміди pBR322 або у складі гібридомної плазміди.

Клітинний клон – це популяція клітин (колонія), які є нащадками однієї клітини і тому містять той самий генетичний матеріал що і попередник (є точними копіями спільного предка)

Усі системи клонування відповідають 2 основним вимогам: