Подтитровка комплемента на сыворотках

Компоненты: трипанозомная позитивная сыворотка ++++ и ++, консервированная 0,5 °/о карболовой кислотой (9,0 см³ сыворотки + 1 см³ 5 о/о-раствора карболовой кислоты на физиологическом растворе).

Нормальных сывороток—две. Сыворотки берут той же давности, что и испытуемые. Трипанозомные и нормальные сыворотки наливают в пробирки по 0,1 (т. е. из разведения 1 :5 по 0,5) и комплемент титруется из них с антигеном и без антигена. Дозы комплемента (из основного разведения 1 :20) разливают на 2 интервала ниже против титра его в гемолитической системе: если титр комплемента в гемолитической системе 0,25 о/о, то начинают с 0,19; 0,22; 0,25; 0,28 и т. д. Во все пробирки вместо недостающего до 0,5 см³ количества комплемента добавляют физиологический раствор: в 1-ю пробирку—0,31, во 2-ю—0,28 и т. д. После разливки нормальных и трипанозомных сывороток, трипанозомного антигена и соответствующих доз комплемента пробирки для связывания ставят на 20 минут в водяную баню при 37°С, после чего добавляют по 0,5 гемолизина в рабочем титре и эритроцитов барана (2,5 о/о взвеси). Время реакции в гемолитической системе 15 минут.

Титр комплемента—минимальное количество его, потребное для полного гемолиза взвеси эритроцитов в пробирках с нормальными сыворотками, с антигеном и без антигена, и с трипанозомными без антигена, при соответствующей задержке гемолиза в трипанозомной сстворотке с антигеном, при 37° С в течение 15 минут.,

Разведение комплемента в установленном титре

Пример. Нужно исследовать 100 пробирок. Титр комплемента в бактериологической системе 0,3 в разведении 1 :20, т. е. в каждой пробирке чистого комплемента имеется 0,015 (0,3 :20 ==0,015), следовательно, 0,015Х100 ===115 см³ чистого комплемента и 48,5 см³ физиологического раствора.

Главный опыт

Инактивированные испытуемые сыворотки исследуются в дозе 0,1 и 0,05. Контроля без антигена—только в дозе 0,1. При массовом исследовании допускается постановка реакции в одной пробирке с дозой сыворотки 0,1 с дополнительным исследованием всех сывороток, давших задержку гемолиза в дозах 0,1 и 0,05. Остальные компоненты—в установленных титрах и объёме. Связывание продолжается 20 минут и гемолизирование 15 минут.

Основные контроли главного опыта. 1. Нормальные и позитивный сыворотки с антигеном и без антигена в дозах 0,1.

2. Антиген в рабочей дозе без сыворотки.

3. Контроля гемолитической системы.

Оценка результатов реакции. Официальная диагностическая доза сыворотки, по которой даётся результат (ответ),—0,1. Доза 0,05 является вспомогательно-контрольной, и результаты, полученные с ней, оцениваются вдвойне крестами, например, ++ оценивается за ++++, + за ++ и т. д.

Результат реакции оценивается 2 раза. Первый раз тотчас после водяной бани, второй—через 12 часов стояния проб при комнатной температуре. Оценка даётся по следующей схеме:

а) положительная реакция ...............................++++, +++, ++

б) сомнительная » ................................ + + -

в) отрицательная » ............................... -

Результат исследования выражается словами: положительная, сомнительная и отрицательная реакции, с указанием количества крестов.

Данные всех опытов титраций и особенности серологических реакций вносятся в дневник серологических работ лаборатории. Для определения результатов реакции в процентах гемолиза изготовляют следующую шкалу.

Из реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом эритроцитов и жидкость сливают в 1 пробирку. Эта жидкость по цвету равняется 100 о/о гемолиза. Из неё приготовляют разведения с меньшим процентом гемолиза по следующей схеме:

№ пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Гемолизировапная жидкость . Физиологический раствор .... Процент гемолиза .......	0,2 1,8 10	0,4 1,6 20	0,6 1,4 30	0,8 1,2 40	1,0 1,0 50	1,2 0,8 60	1,4 0,6 70	1,6 0,4 80	1,8 0,2 90

Шкалой пользуются тогда, когда эритроциты в пробирках главного опыта осели на дно. Оценку производят путём сравнения процента гемолиза и количества крестов.

Представленные на исследование сыворотки должны быть свежими (не больше 1—2 дней с момента взятия). Сыворотки, загнившие и гемолизированные для исследования непригодны. Сыворотки здоровых ослов при подтитровке комплемента на нормальных лошадиных сыворотках дают неспецифическую задержку.