Журнал неврологии и психиатрии / 2010 / NEV_2010_11_041

Ранее в этом журнале была опубликована статья «Цитокиновый профиль в остром периоде клещевых нейроинфекций у детей» [8], в которой обсуждалась проблема в целом и роль иммунологических исследований в изучении патогенеза и дифференцированной коррекции иммунных нарушений в терапии клещевых нейроинфекций. Было установлено, что применение циклоферона в качестве иммуномодулятора в комплексной терапии в остром периоде болезни способствует ускорению регресса клинических проявлений общеинфекционного синдрома, менингеальных симптомов и усилению продукции интерферона-γ при менингоэнцефалитической форме таких инфекций. В соответствии с этим был поставлен вопрос о необходимости дальнейшего изучения иммунопатогенетических особенностей клещевых инфекций. Настоящая работа является продолжением указанного исследования.

Цель работы состояла в оценке влияния иммунотерапии с применением циклоферона на состояние функциональной активности лейкоцитов периферической крови при различных этиологических вариантах и клинических формах клещевых инфекций у детей.

При постановке исследования мы учитывали данные литературы о роли полиморфноядерных лейкоцитов в противовирусной защите. Известно, что в этих клетках синтезируется большинство ферментов, способствующих повреждению тканей и межклеточного вещества во время воспаления [1, 3]. Нейтрофилы обладают защитным потенциалом, опосредованным различными механизмами, в частности — дефензинами, которые характеризуются противовирусной активностью и являются мощными хемоаттрактантами для моноцитов [1]. Дефензины могут проявлять функциональные свойства, важные в реализации защитно-приспособительных реакций организма при

инфекции, и рассматриваются в качестве соединений, опсонизирующих микроорганизмы при фагоцитозе и воспалении. Известна их способность влиять на течение фагоцитарного и воспалительных процессов, где они выступают в роли регуляторных молекул [1, 3—5]. При стимуляции нейтрофилов дефензины выделяются во внеклеточное пространство и накапливаются в биологических жидкостях организма. Эти катионные белки, обладая цитотоксической активностью, способны оказывать не только защитное, но и повреждающее действие на организм хозяина [2, 9—11]. В связи со сложностью дифференциальной диагностики клещевых инфекций в остром периоде большое значение приобретает комплексная коррекция воспалительного процесса с применением не только этиотропной терапии, но и воздействия на функциональную активность лейкоцитов.

Материал и методы

Исследование было основано на анализе 629 клинических случаев клещевых инфекций у детей в возрасте от 1 года до 14 лет (средний 9,8±0,5 года). Все больные лечились в клинике неврологии Кемеровской государственной медицинской академии в 1997—2007 гг.

Во всех случаях проводилось иммунологическое определение этиологии заболевания: определение IgG и IgM к возбудителю исходного клещевого боррелиоза (ИКБ) — B.burgdorferi в парных сыворотках крови проводилась методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих диагностических наборов («DAKO», Дания; «Омникс», Санкт-Петербург); к возбудителю моноцитарного эрлихиоза человека (МЭЧ) E. chaffensis и к возбудителю гранулоцитарного анаплазмоза человека (ГАЧ) А. phagocytophila — методом ИФА («Омникс», Санкт-Петербург), к вирусу клещевого энцефалита (КЭ) — в реакции торможения гемагглютинации с антигеном вируса.

Окончательный диагноз подтверждался комплексной экспертной комиссией с учетом эпидемиологического анамнеза, результатов серологических реакций, клинических особенностей и данных ликворологических исследований.

Перечисленные выше обозначения фигурируют в табл. 1, где приведено распределение больных по клиническим формам и этиологии заболевания.

В динамике заболевания проводились также общеклинические, биохимические и нейрофизиологические исследования.

Во всех случаях в качестве основного лечения применялись иммуноглобулин человеческий против клещевого энцефалита, антибиотики, дезинтоксикационная и симптоматическая терапия. В 160 случаях кроме основного лечения проведен курс терапии циклофероном: 10 внутримышечных инъекций 12,5% раствора 1 раз в сутки: в 1-е, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16-е и 18-е сутки. Суточная терапевтическая доза препарата составляла 6—10 мг/кг массы тела. Курс лечения циклофероном начинался на 2—3 дни от начала заболевания.

Для определения цитохимических показателей функциональной активности лейкоцитов периферической крови использовался спонтанный НСТ-тест (сНСТ-тест). Реакция основана на восстановлении нитросинего тетразолия («Sigma», США) до нерастворимой формы — диформазана [6]. Результат выражался в процентах диформазан-позитивных клеток на 100 нейтрофилов. Для определения функционального резерва нейтрофилов проводился индуцированный НСТ-тест (иНСТ-тест) с использованием в качестве индуктора 0,1% раствора зимозана («Sigma»,США). Индекс стимуляции (ИС) рассчитывался отношением показателей иНСТ и сНСТ-тестов.

Всего обследованы 288 детей с различными клиническими формами клещевых инфекций, из них 160 получили курс лечения циклофероном. В группе здоровых детей (30 человек) показатель сНСТ-теста составлял 5,9±0,22%, иНСТ — 13,4±0,7%.

Содержание дефензинов в плазме крови 52 больных (у 29 из них лечение включало циклоферон) определяли с помощью иммуноферментного анализа. Контролем служил HNP-1 (human neutropil peptide-1). Плазму получали путем центрифугирования при 3000 об/мин крови, взятой с консервантом (3,8% цитрат натрия) в соотношении 9:1. Забор материала для исследований показателей НСТтестов, дефензинов, специфических антител к возбудителям клещевых инфекций проводился в острый период (2—3-и сутки от начала заболевания) и в период регресса клинических проявлений (на 18—21-е сутки от начала заболевания).

Статистическая обработка количественных данных проводилась в системе Windows-XP c использованием программ Excel, Origin. Методом корреляционного анализа

определяли сопряженность между разнородными признаками (коэффициент ассоциации — r). При математической обработке использовали t-критерий, среднее арифметическое (x), стандартное отклонение (S²х), коэффициент вариации (CV), ошибку (Sx) средней арифметической и коэффициент точности (CS).

Результаты и обсуждение

Все рассматриваемые клинические случаи характеризовались общим эпидемиологическим анамнезом и преобладанием в клинической картине болезни общеинфекционных проявлений (неспецифичные для отдельных нозологических форм).

Микстинфекции проявлялись преимущественно в виде общеинфекционного синдрома, серозного менингита и менингоэнцефалита, характеризовались острым началом и более тяжелым течением в сравнении с моноинфекциями.

При лихорадочной форме микстинфекции КЭ и ИКБ у всех больных отмечена фебрильная лихорадка длительностью 6,7±0,9 дней, что больше в сравнении с лихорадочной формой КЭ (р<0,05) и ИКБ в стадии ранней диссеминации (р<0,05). При микстинфекции у всех больных выявлялись общемозговые симптомы, сохранявшиеся в течение 4,5±0,3 дня. Признаки раздражения мозговых оболочек при отсутствии воспалительных изменений в спинномозговой жидкости (СМЖ) были отмечены у 48% больных. В случаях применения циклоферона при лихорадочных формах моноинфекций КЭ и ИКБ, а также микстинфекции КЭ и ИКБ влияния иммунотерапии на клинические показатели не отмечено.

При серозном менингите смешанной этиологии менингеальные симптомы сохранялись в течение 12,9±1,1 дня (при КЭ — 6,4±1,0 дня, р<0,001, при ИКБ — 7,5±0,6 дня; р<0,01), общемозговые симптомы — в течение 13,3±1,3 дня. В случаях применения циклоферона при менингеальных формах микстинфекции КЭ и ИКБ, ИКБ и МЭЧ выявлено уменьшение продолжительности общемозговых проявлений (до 6,5±0,5 дня; р<0,05) и менингеальных симптомов (до 7,6±0,8 дня; р<0,05), что сопоставимо с данными показателями при моноинфекциях.

При менингоэнцефалитической форме микстинфекции КЭ и ИКБ на фоне выраженного общеинфекционного синдрома наблюдалась клиническая картина нарастающего отека головного мозга с угнетением сознания и судорогами с последующим формированием параличей и когнитивных нарушений. Воспалительные изменения в СМЖ проявлялись смешанным или лимфоцитарным цитозом 152,5±33,5 клеток в 1 мкл. Менингеальный синдром наблюдался более длительно (21,1±1,6 дня), чем при КЭ (14,8±1,7 дня, р<0,05). Общеинфекционные проявления

были также более продолжительными (19,8±2,1 дня) в отличие от КЭ (13,4±1,6 дня, р<0,05). В случаях применения циклоферона при менингоэнцефалитических формах КЭ, ИКБ, микстинфекции КЭ и ИКБ, КЭ и ГАЧ, а также КЭ, ИКБ и МЭЧ отмечено достоверное снижение продолжительности лихорадочного периода (6,9±2,0 дня, р<0,01), менингеальных проявлений (11,1±1,5 дня, р<0,05) и кратности судорожных припадков (р<0,05). На фоне иммунотерапии количество лейкоцитов и процентное содержание сегментоядерных нейтрофилов достигали нормальных значений на 2-й неделе от начала лечения (при отсутствии в схеме лечения циклоферона изменения в гемограмме сохранялись в течение 5—6 нед). При сочетании КЭ с ГАЧ и МЭЧ наблюдалось повышение уровня аминотрансфераз в крови, которое на фоне применения циклоферона регрессировало в течение 10—14 дней (в контрольной группе — до 20 дней, р<0,05).

Влияния терапии циклофероном на клиническое течение и изменения лабораторных показателей при локальных формах ИКБ (эритема, регионарная мононевропатия, синдром Баннварта) не выявлено.

Изучение функциональной активности нейтрофилов характеризует все этапы воспалительного процесса и позволяет оценить его тенденции. НСТ-тест определяет итоговую реакцию одной из ключевых ферментативных систем, ответственных за цитотоксический потенциал лейкоцитов за счет вырабатываемых ими активных форм кислорода, а их дополнительная стимуляция выявляет функциональные резервы биоцидности клеток. Индуцированный НСТ-тест можно рассматривать как цитохимический критерий готовности к завершенному фагоцитозу. Поэтому результаты, получаемые при постановке НСТтеста достоверно отражают не только сам процесс повреждения, но и динамику его развития и исход [6]. Динамика биоцидности лейкоцитов при различных клинических формах клещевых инфекций представлена в табл. 2.

При лихорадочных формах клещевых инфекций отмечено повышение биоцидности нейтрофилов, что проявлялось увеличением показателей сНСТ-теста до 8,1±0,38%, иНСТ-теста — до 41,41±3,45%, а ИС — до 4,67±0,2, что свидетельствовало о существенном резерве биоцидности лейкоцитов, не смотря на их значительную активацию с первых дней болезни. Уровень биоцидности коррелировал с продолжительностью лихорадки (r=0,7; р<0,05). По мере регресса клинических симптомов наблюдалось снижение значений сНСТ-теста до 6,1±0,17% (р<0,05), возрастание показателя иНСТ-теста до 46,8±3,35% и ИС до 5,6±0,25 (р<0,05). На фоне терапии циклофероном ИС возрастал в динамике до 7,2±0,25 (р<0,05), что отражало восстановление резерва биоцидности. Динамика показателей сНСТ, иНСТ-тестов и ИС при лихорадочных формах микст- и моноинфекций была од-

нонаправленной и соответствовала клинической выраженности общеинфекционного синдрома.

При менингите выявлена максимальная функциональная активность нейтрофилов и мобилизация биоцидного потенциала. Значения сНСТ-теста возрастали до 13,8±0,9%, что в 1,7 раза больше, чем при лихорадочных формах. Уровень биоцидности коррелировал с длительностью лихорадки (r=0,7, р<0,05) и воспалительными изменениями в СМЖ (r=0,5; р<0,05); иНСТ-тест возрастал до 48,77±2,73% (р<0,05), однако ИС при этом снижался до 3,11±0,25 (р<0,01 в сравнении с лихорадочными формами). В динамике сНСТ-тест снижался до 10,75±0,54% (р<0,05), превышая данный показатель при лихорадочных формах в 1,7 раза. ИС возрастал до 5,0±0,25, что в 1,8 раза больше, чем в остром периоде. На фоне терапии циклофероном ИС возрастал в динамике до 6,65±0,3 (р<0,05), что характеризовало повышение биоцидного потенциала нейтрофилов и соответствовало регрессу клинических симптомов.

Показатель сНСТ-теста при менингоэнцефалите варьировал от 2,6 до 12,7% (в среднем — 8,35±1,37%), что меньше, чем при менингите (p<0,05). Отмечались низкие показатели иНСТ-теста — 28,03±2,61%, что в 1,7 раза ниже в сравнении с менингитом (p<0,01). ИС снижался до 2,9±0,35 (p<0,05). Снижение показателей ИС в сочетании с нарастанием значений сНСТ-теста в динамике соответствовало неблагоприятному течению болезни и свидетельствовало об отсутствии адекватной реакции нейтрофилов на стимулирующее воздействие медиаторов воспаления. На фоне терапии циклофероном ИС оставался стабильным или незначительно возрастал в динамике. Это характеризовало относительную сохранность биоцидного потенциала, что представляется особенно важным с учетом достоверного влияния иммунотерапии на тяжесть клинических проявлений менингоэнцефалита.

Динамика показателей дефензинов при различных клинических формах клещевых инфекций представлена в табл. 3. Уровень дефензинов в остром периоде лихорадочной формы КЭ составлял 84,0±8,5 нг/мл, что значительно меньше в сравнении с микстинфекциями и ИКБ (соответственно 124±9,8 нг/мл и 115±9,4 нг/мл, р<0,05). В динамике заболевания уровень дефензинов имел отчетливую тенденцию к снижению и соответствовал клинической выраженности общеинфекционного синдрома. При микстинфекциях отмечались закономерно более высокие показатели дефензинов в сравнении с моноинфекциями. На фоне иммунотерапии циклофероном рост показателей дефензинов был менее значительным, однако статистически значимых отличий не выявлено. При менингеальной

форме КЭ в остром периоде показатели дефензинов составляли 80±8,5 нг/мл, что меньше в сравнении с микстинфекциями (112±6,3 нг/мл) и несколько выше, чем при ИКБ в стадии ранней диссеминации (65±9,3 нг/мл). В период регресса общеинфекционных проявлений количество дефензинов снижалось до 62±8,3 нг/мл. При микстинфекциях уровень дефензинов был выше, чем при менингеальной форме КЭ, и составлял в среднем 90±5,4 нг/ мл (р<0,05), значительно превышая данный показатель при ИКБ — 50±6,8 нг/мл (р<0,05). Отмечено что степень воспалительных изменений в СМЖ коррелировала с показателями дефензинов (r=0,6; p<0,05). Достоверного влияния иммунотерапии циклофероном на динамику показателей дефензинов при менингеальных формах клещевых инфекций не выявлено. При менингоэнцефалитической форме течения инфекции отмечалось наиболее выраженное нарастание концентрации дефензинов в отличие от лихорадочных и менингеальных форм. Так, при КЭ данный показатель возрастал до 135±7,4 нг/мл в разгар клинических проявлений и значительно снижался в динамике, составляя 81±5,4 нг/мл. Необходимо отметить, что на фоне иммунотерапии повышение уровня дефензинов было менее значительным и составляло 102,2±6,3 нг/мл, при этом в динамике заболевания данный показатель был стабилен, что соответствовало тяжести клинических проявлений. При микстинфекции отмечены максимальные показатели дефензинов — 189±16,4 нг/мл с последующим снижением в динамике заболевания до 138±5,4 нг/мл. На фоне иммунотерапии также отмечено менее выраженное повышение данных показателей (127,2±7,4 и 111,1±6,5 нг/мл).

Полученные результаты подтверждают значение ИС как интегрального показателя, отражающего общий флогогенный потенциал лейкоцитов крови, выражающийся как в реальной, так и потенциальной их готовности к ответу на стимулирующие воздействия. Чем ниже ИС, тем эта готовность меньше и менее эффективны репаративные процессы, что находит отражение в клинических проявлениях рассматриваемых инфекций.

Динамика показателей ИС на фоне применения циклоферона свидетельствует о существенном влиянии иммунотерапии на сохранность и процесс восстановления биоцидности лейкоцитов независимо от этиологии клещевой инфекции. Анализ динамики уровня дефензинов при различных клинических формах клещевых нейроинфекций выявил более выраженные изменения при микстинфекции, поэтому коррекция неспецифического звена иммунитета является важным компонентом комплексного лечения данной патологии. Высокие показатели де-

фензинов при менингоэнцефалитической форме отражают глубину патологического процесса и тяжесть клинического течения заболевания.

Усиление тяжести клинических проявлений при микстинфекции в сравнении с моноинфекциями свидетельствует о важной роли макроорганизма, в частности — выраженности системных воспалительных реакций в формировании особенностей клинического течения и исхода. Снижение биоцидного потенциала нейтрофилов, как правило, сопровождается наиболее тяжелыми клиническими проявлениями. Степень и динамика функциональной активности лейкоцитов отражают тяжесть тече-

ния болезни и могут иметь прогностическое значение. Применение циклоферона в остром периоде болезни способствует восстановлению резервов биоцидности лейкоцитов, что позволяет расценивать иммунотерапию как патогенетически обоснованную и эффективную, особенно в отношении наиболее тяжелых — менингеальных и менингоэнцефалитических форм клещевых инфекций. Важным преимуществом иммуномодулирующей терапии является возможность ее использования в комплексном лечении до серологического подтверждения диагноза вне зависимости от этиологии заболевания.

ЛИТЕРАТУРА

1.Долгушин И.И. Роль нейтрофилов в регуляции антимикробной резистентности. Вестн РАМН 2002; 3: 16—21.

2.Кокряков В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения. Ст-Петербург: Наука 1999; 162.

3.Кокряков В.Н., Ковальчук Л.В., Алешина Г.М., Шамова О.В. Катионные противомикробные пептиды как молекулярные факторы иммунитета: мультифункциональность. Журн микробиол эпидемиол и иммунол 2006; 2: 98—105.

4.Коренберг Э.И. Комплексный подход к изучению и профилактике инфекций, передающихся иксодовыми клещами. Эпидемиол и вакцинопрофилакт 2003; 2: 32—36.

5.Кудин А.П. Содержание дефензинов у детей с генерализованными формами менингококковой инфекции. Рос педиат журн 2001; 5: 9—11.

6.Маянский А.Н., Викеман М.Е. Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинего тетразолия. Методические рекомендации. Казань 1979.

7.Попонникова Т.В., Вахрамеева Т.Н., Галиева Г.Ю. Изменения кислородзависимой биоцидности и морфологических особенностей лейкоцитов крови при микстинфекции клещевого энцефалита и иксодового клещевого боррелиоза у детей. Медицина в Кузбассе 2008; 5: 121— 125.

8.Попонникова Т.В., Бедарева Т.Ю., Вахрамеева Т.Н., Галиева Г.Ю. Цитокиновый профиль в остром периоде клещевых нейроинфекций у детей. Журн неврол и психиат 2010; 110: 5: 9—13.

9.Chertov О., Michel D.F., Xu L. et al. Identification of defensin-1, defensin-2 and CFP37/azurocidin as T-cell chemoattractant protein released from in- terleucin-8-stimulated neutrophils. J Biol Chem 1996; 271: 6: 2935—2940.

10.Ganz T. Antimikrobial polipeptides. Biol 2004; 75: 34—38.

11.Yang D., Biragyn A., Hoover D.M. Multiple roles of antimicrobial defensins and eosinophil-derived neurotoxin in host defense. Ann Rev Imm 2004; 22: 170—175.