Журнал неврологии и психиатрии / 2010 / NEV_2010_06_095

Болезнь Паркинсона (БП) — хроническое нейродегенеративное заболевание, сопровождающееся прогрессирующей гибелью дофаминергических нейронов в головном мозге, резким снижением концентрации нейромедиатора дофамина в полосатом теле и накоплением внутриклеточных включений в нейронах (тельца Леви), главным компонентом которых является белок α-синуклеин. Одной из причин поражения нейронов при БП считают окислительный стресс [7, 13]. В результате окисления дофамина при участии моноаминооксидазы В образуется супероксидный радикал, обусловливающий развитие окислительного стресса [12, 15] с нарушением равновесия между прооксидантной и антиоксидантной системами. Известно, что при старении уменьшается продукция основных антиоксидантных ферментов, в результате чего увеличивается чувствительность к оксидантному стрессу [4], что может быть одной из причин возрастного снижения резистентности дофаминергических нигростриатных нейронов к пропаркинсоническим факторам. Таким образом, одним из перспективныx направлений в лечении БП является антиоксидантная терапия [5, 10], особенно в начальной стадии развития болезни.

Целью исследования явилось изучение процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также определение содержания фосфолипидов (ФЛ), галактозилцерамидов (ГалЦер), сульфогалактозилцерамидов (СГалЦер) и продукта их гидролитического расщепления — сфингозина в головном мозге животных с экспериментально вызванным паркинсоническим синдромом (ПС) и при введении нового синтезированного нами препарата. В структуру исследуемого вещества входят литий и аминокислота цистеин1. Препараты лития применяют при различныx нейродегенеративныx заболеванияx. Ионы лития повышают чувствительность нейронов гиппокампа и других областей мозга к действию дофамина. Литий конкурирует

1Исследуемый препарат синтезировали в ЗАО при заводе химических реактивов.

© Коллектив авторов, 2010

Zh Nevrol Psikhiatr Im SS Korsakova 2010;110:6:95

с ионами натрия, участвуя в регуляции работы кальциевых каналов в митохондриях, а также снижает активацию апоптозного каскада [11]. Цистеин оказывает выраженное антиоксидантное действие и является источником серы, инактивирующим свободные радикалы. Его рекомендуют применять при синдроме хронической усталости, рассеянном склерозе, БП и болезни Альцгеймера.

Материал и методы

Эксперименты проводили на беспородных белых старых крысах (возраст 2—2,5 года), содержащихся в условиях вивария. Модель экспериментального ПС осуществляли ежедневным внутрибрюшинным введением МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрапиридин) в дозе 25 мг/кг в течение 6 дней. Поведенческие характеристики (координация движений, тремор, ригидность мышц, олигокинезия) служили критерием развития болезни. Животные были распределены на 3 группы по 10 животных в каждой: 1-я — интактные; 2-я — животные с воспроизведенным ПС; 3-я — животные с воспроизведенным ПС, получавшие исследуемый препарат в дозе 20 мг/кг. Исследуемое вещество вводили с 6-го по 12-й дни эксперимента, через 1 ч после введения МФТП. Животных забивали на 12-й день эксперимента через 1 ч после введения препарата.

Об активности ПОЛ судили по количеству образования гидроперекисей (ГП) и малонового диальдегида (МДА). ГП определяли по цветной реакции с тиоционатом аммония при максимуме поглощения 480 нм [9]; МДА

— по реакции с тиобарбитуровой кислотой [2]; количество белка — по Лоури [14].

Экстракцию липидов осуществляли по методу Фолча. Фракционирование индивидуальных фосфолипидов проводили методом одномерной хроматографии в тонком слое силикагеля («Мерк», Германия) в системе растворителей хлороформ:метанол:аммиак в соотношении (65:35:5). Минерализацию липидного фосфора осуществляли в среде серной и азотной кислот с последующим расчетом ко-

e-mail: lhovs@yahoo.com

личества неорганического фосфора в мкг влажной ткани [6].

Выделение осадка ГалЦер и СГалЦер основано на их способности образовывать плотный белый слой на границе хлороформенного и водного слоев при обработке хлороформенно-метанолового экстракта липидов трихлоруксусной кислотой и водой. Фракционирование суммарных ГалЦер и СГалЦер проводили методом тонкослойной хроматографии (пластины «Мерк», Германия) в системе растворителей хлороформ-метанол-концентрированный аммиак (80:20:0,4). Количество ГалЦер определяли по углеводному компоненту с резорцином, а СГалЦер — по сульфатной группе в реакции с азуром [8].

Для выделения сфингозиновых оснований смесь ГалЦер и СГалЦер подвергали кислотному метанолизу смесью Н2SO4-метанол (1:20) при температуре 78—80°C в течение 6 ч, с последующей экстракцией сфингозиновых оснований диэтиловым эфиром. Количество сфингозина определяли цветной реакцией с метилоранжем при длине волны 415 нм [8].

Статистическую значимость различий оценивали методом Стьюдента.

Результаты и обсуждение

В головном мозге интактных животныx обнаружен определенный стационарный уровень интенсивности свободнорадикальных реакций; развитие ПС сопровождалось активированием процесса ПОЛ, что выражалось в увеличении содержания ГП и МДА (см. рисунок). Известно, что при БП в черной субстанции снижено число глиальныx клеток, содержащиx естественный антиоксидант — глутатионпероксидазу, а также отмечен низкий уровень глутатиона [3, 12]. Низкий уровень антиоксидантов сопровождается высоким уровнем активных форм кислорода, обладающих свойствами ингибировать сульфгидрильные группы ферментов и повреждать NН2-группы мембранных белков. В этих условиях целесообразно использование препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами.

Было проведено изучение влияния синтезированного антиоксидантного препарата на ПОЛ в головном мозге животных с экспериментальным ПС. Введение исследуемого вещества животным с экспериментальным ПС приводит к нормализации количества перекисей, приближая их к показателям контрольных животных, что является доказательством способности препарата оказывать антиоксидантное действие (см. рисунок).

Механизмнейропротекторногодействияиспользованного нами вещества связан с тем, что в его структуру входит цистеин, который принимает участие в синтезе глутатиона. Глутатион — трипептид, образованный аминокислотами цистеином, глутаминовой кислотой и глицином. Его основной антиоксидантный эффект реализуется посредством участия в работе антиоксидантных ферментов глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы. Глутатион, как и другие SН-содержащие белки, является акцептором активных форм кислорода и тем самым ингибирует свободнорадикальное окисление. Снижение содержания глутатиона приводит к повышению чувствительности митохондрий к окислительному стрессу.

Активные формы кислорода, вызывая ПОЛ, могут быть токсичными как для нейронов, так и олигодендро-

Содержание продуктов перекисного окисления липидов (в нмоль/мг белка) в головном мозге крыс в норме, при экспериментальном паркинсоническом синдроме и при лечении антиоксидантным препаратом.

По оси абсцисс: 1 — контроль; 2 — паркинсонизм; 3 — лечение.

* — достоверные различия между 2-й и 3-й группами на уровне p<0,001.

цитов, образующих миелин. Высокое содержание в головном мозге липидов и уникальность их структуры определяет характер развития в них ПОЛ. Известно, что изменение состава липидов в мембране клеток, наряду с метаболическими изменениями, чаще всего бывает вызвано процессами свободнорадикального окисления. Изучение спектра ФЛ в мозговой ткани при экспериментальном ПС (табл. 1) позволило обнаружить увеличение содержания лизофосфатидилхолина (ЛФM) при уменьшении содержания фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилсерина (ФС) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ). Жирнокислотные остатки указанных фосфолипидов легко подвергаются окислению свободными радикалами при активировании ПОЛ.

Известно, что для БП характерно понижение митохондриального комплекса 1 в дофаминергических нигростриатных нейронах. При посмертном гистологическом исследовании мозга больных было обнаружено снижение активности фермента NАДФН-убихинон-оксидоредук- тазы [7]. Уменьшение активности фермента вызывает нарушение работы нейрональных митохондрий и снижение продукции АТФ и, как следствие, понижение активности АТФ-зависимых ферментов, в частности Nа-, К-АТФаз. В результе происходит деполяризация мембраны клеток, усиливаются интенсивность ионных потоков через мембрану и массированное поступление Са2+ в нейрон, запускающее весь каскад внутриклеточных нейродегенеративных реакций, нарушается также работа Са-насоса, откачивающего Са2+ из клетки. Образование активных форм кислорода и увеличение ионов Са2+ в митохондриях также приводит к активации фосфолипаз, отщепляющих жирные кислоты во втором положении молекулы ФЛ. Наблюдаемое уменьшение содержания ФХ, ФС, ФЭ при параллельном увеличении содержания ЛФХ, вероятно, связано с повышением активности фосфолипаз при развитии ПС.

Исследование нейтральных гликолипидов позволило обнаружить в головном мозге интактных животных 2 фракции ГалЦер и 2 фракции СГалЦер, различающиеся между собой содержанием жирных кислот (табл. 2). ГалЦер преимущественно локализованы в миелине, тогда как

витии нейродегенеративных заболеваний (болезнь Паркинсона и Альцгеймера). Нейрохимия 1995; 2: 3—15.

4.Гусев Б.А., Панченко Л.Ф. Нейрохимия. Современные концепции свободнорадикальной теории старения. M 1997; 14: 1: 14—27.

5.Катунина Е.А. Возможности применения антиоксидантной терапии у больных болезнью Паркинсона. Эксперим и клин фармакол 2005; 68: 5: 18—20.

6.Кейтс М. Техника липидологии. М 1975; 298.

7.Крыжановский Г.Н., Карабань И.Н., Магаева С.М. и др. Болезнь Паркинсона. Татарстан 2002; 336.

8.Методы биохимических исследований. Под ред. М.И. Прохорова. Ленинград: ЛГУ 1982; 271.

apoptosis in rabbit hippocampus by preventing citochrome c translocation, Bcl-2 decreas. Bax elevation and caspase-3 activation. J Neurochem 2002;

82:1: 137—145.

12.Damier P., Hirsch E.C., Zhang P. Glutathione peroxidase, glial cells and Parkinson’s disease. Neuroscience 1993; 52: 1—6.

13.Kidd P.M. Parkinson’disease as multifactorial oxidative neurodegeneration. Altern Med Rev 2000; 5: 6: 502—529.

14.Lowry N.J., Rosenbogh A.J., Farr A.L. Protein measurement with folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265—275.

15.Olanow C.W. Oxidation reaction in Parkinson’s disease. Neurology 1990;

40:32—37.