Журнал неврологии и психиатрии / 2010 / NEV_2010_04_084

Наследственные факторы играют значительную роль в этиопатогенезе зависимости от психоактивных веществ (ПАВ): описаны факты «накопления» случаев алкоголизма в семьях больных, показано повышение риска заболевания алкоголизмом и наркоманиями в семьях с отягощенной наследственностью [3, 5, 7]; предполагают также наличие биологической предрасположенности к зависимости от ПАВ на генетическом уровне [1, 6, 15, 16]. Однако природа и механизмы наследования предрасположенности остаются неясными. Согласно данным медицинской генетики [7, 17, 21], наследование предрасположен-

ности к наркологическим заболеваниям относят к полилибо олигогенному типу, предполагающему вовлеченность нескольких генов и не подчиняющегося менделевским принципам.

Нейрохимической основой феномена зависимости от ПАВ считается хроническая дисфункция дофаминовой (ДА) нейротрансмиттерной системы мозга, в первую очередь затрагивающая систему подкрепления [2, 14, 15]. Предполагается существование центрального патофизиологического механизма становления и поддержания зависимости от ПАВ [1, 2], находящегося под генетическим

контролем, который не зависит от конкретного вида ПАВ и обеспечивает глубокие нейрохимические изменения у будущего больного еще до встречи с ПАВ, что и определяет биологическую базу собственно предрасположенности.

Клинические проявления зависимости от ПАВ выступают в качестве сложного фенотипа (фенотипа аддикции), определяемого многовариантным взаимодействием системы генов (генотипическим профилем аддикции), прежде всего дофаминовой нейротрансмиттерной системы. Значительная фенотипическая (клиническая) гетерогенность болезней зависимости от ПАВ в сочетании с генетической гетерогенностью диктует необходимость функционального подхода к поиску генов-кандитов, вовлеченных в этиопатогенез зависимости.

Многие гены содержат вариабельные участки ДНК (полиморфные локусы), структура которых различна в популяции человека. Предполагается, что определенные варианты полиморфизма могут быть связаны с наследственными заболеваниями. Одним из инструментов генетики полигенных заболеваний является метод ассоциативных исследований, направленный на поиск статистически достоверных различий между частотами встречаемости того или иного варианта полиморфизма в выборках больных по сравнению с контрольной выборкой здоровых субъектов, а также между группами больных с различными клиническими фенотипами заболевания. Выявление подобных различий подтверждает возможную взаимосвязь или ассоциацию между определенным видом полиморфизма и заболеванием. Если известно, что вариант полиморфизма изменяет функционирование продукта экспрессии гена (функциональный полиморфизм), то положительный результат ассоциативного исследования может служить подтверждением вовлечения гена, несущего полиморфный локус, в этиопатогенез заболевания.

Одним из важных звеньев ДА системы является фермент катехол-О-метил-трансфераза (СОМТ, EC 2. 1.1.6), ключевой модулятор дофаминергической и норадренергической нейромедиации [13], контролирующий биотрансформацию ДА по пути образования метилированных продуктов. В экзоне 3 гена СОМТ (хромосомный локус 22q11.2) обнаружен функциональный полиморфизм Val158Met, в котором замена нуклеотида (gtg→atg) приводит к замене аминокислот (валин на метионин) при синтезе белка СОМТ. Один из полиморфных аллелей — H (Val, валин) обеспечивает нормальную активность фермента, второй — L (Met, метионин) вызывает 3—4-крат- ное снижение активности СОМТ [10]. Предполагается, что Val158Met полиморфизм гена СОМТ может вносить вклад в этиологию психических заболеваний, включая и алкоголизм [22], а носители аллеля L должны иметь относительно низкий уровень инактивации дофамина и выраженную предрасположенность к развитию зависимости от алкоголя [19].

Изучение связи функционального полиморфизма гена СОМТ с алкоголизмом и наркоманией проводилось несколькими группами исследователей [4, 9, 11—13, 18— 20], но вопрос о связи наследственной отягощенности по наркологическим заболеваниям и вариантами этого полиморфного локуса остается неясным. Наследственная отягощенность является наиболее четким, клинически и анамнестически выявляемым фактором, заставляющим предполагать наличие биологической (генетической)

предрасположенности у больного. На наш взгляд, имеет значение не только факт наличия отягощенности, но и ее количественная оценка — степень отягощенности (количество случаев наркологических заболеваний в семье пациента). Клинический анализ выявляет широкий спектр степени отягощенности у наркологических больных — от 1 до 6—9 больных в семье. Мы предположили, что в случае связи вариантов полиморфного локуса гена СОМТ с генетической предрасположенностью к болезням зависимости, будет наблюдаться накопление либо элиминация определенных аллелей или генотипов в группах больных с отягощенностью, возможно, пропорциональное степени отягощенности. Если выявленные варианты полиморфизма являются патогенетическими маркерами предрасположенности, то сдвиги частот, возможно, окажутся близкими для больных алкоголизмом и героиновой наркоманией.

Целью данного ассоциативного исследования стало сравнительное изучение структуры полиморфного локуса Val158Met гена COMT у больных алкоголизмом и героиновой наркоманией с различной степенью семейной отягощенности по наркологическим заболеваниям.

Материал и методы

Были обследованы пациенты, находившиеся на лечении в клинике Национального научного центра наркологии. Все они были мужчины славянской этнической принадлежности, неродственные между собой.

Они составили две основных группы. В 1-ю вошли 395 пациентов с диагнозом «зависимость от алкоголя» 2—3 стадии (F10.2 по МКБ-10); их средний возраст был 37,5±6,2 года. Во 2-ю основную группу вошли 243 пациента с диагнозом «зависимость от опиатов» (героин) (F11.2 по МКБ-10); их средний возраст был 27,3±4,4 года.

Из исследования были исключены лица с психическими расстройствами (шизофрения, депрессивные расстройства, суицидальные попытки).

Анализ семейной отягощенности проводили в процессе опроса больного и его родственников. Каждая из основных групп пациентов была разделена на подгруппы: семейно отягощенные — FH и семейно не отягощенные FH0. У небольшой части пациентов не удалось получить достоверных сведений о семейной отягощенности (группа НД) и они были исключены из дальнейшего анализа. Затем группа FH была разбита на подгруппы в зависимости от степени отягощенности: FH1 (средняя отягощенность — 1 кровный родственник с наркологической патологией), FH2 (высокая отягощенность — 2 кровных родственника и более). Распределение групп больных по степени семейной отягощенности представлена в табл. 1.

Среди больных алкоголизмом доля неотягощенных больных была достоверно меньше (32,7%), чем в группе больных героиновой наркоманией — 41,5% (р=0,037; χ2=4,36 (df=1), OR=1,46 [CI 95% 1,02; 2,08]). Распределение больных по степени отягощенности (средняя или высокая) оказалось одинаковым и не зависело от диагноза. Наследственность больных оказалась в основном отягощена алкоголизмом, лишь у 5 (2%) больных героиновой наркоманией выявлены случаи наркомании в семье (у 2 больных — братья, у 3 — двоюродные братья).

Контрольную группу составили 326 мужчин славянской этнической принадлежности, неродственные между

собой, не имеющие диагностических признаков наркологической патологии, средний возраст 38,5±7,2 года. Участники контрольной группы не изучались с точки зрения семейной отягощенности по наркологическим заболеваниям.

Генотипирование образцов ДНК пациентов, полученных из венозной крови путем фенол-хлороформной экстракции, проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом. Для изучения был выбран полиморфный локус Val158Met (NCBI refSNP ID: rs 4680), относящийся к классу однонуклеотидных замен. Условия реакции и дизайн олигонуклеотидных праймеров доступен по запросу.

При статистической обработке данных в качестве анализируемых показателей использовали частоту аллелей и генотипов (сочетаний этих аллелей) по полиморфному локусу Val158Met гена СОМТ в контроле и группах пациентов. Для анализа результатов использовали статистику χ2 с доверительным интервалом 5%, дающую возможность оценки различий в частоте признака в генеральных совокупностях по частотам признака в ограниченных выборках. При анализе частот генотипов мы применяли метод иерархической агломеративной кластеризации частот, позволяющий выделить группы генотипов с максимально сходными частотами (кластеры). Использовали пошаговый алгоритм кластеризации в пространстве расстояний статистики χ2. На первом шаге все генотипы представляют собой отдельные кластеры. На каждом следующем шаге объединяются кластеры с наиболее близкими отношениями частоты в 2 группах. В результате из большого количества отдельных генотипов выделяется малое число наборов генотипов с приблизительно одинаковым отношением частот. После выделения таких кластеров оценивали степень их гомогенности по тесту χ2. В случае значений р (обозначаемого здесь как рк) много больше 0,05 (обычно мы использовали рк>0,15, чтобы полностью исключить возможную гетерогенность внутри кластера) проводилось сравнение кластерных частот с использованием статистики χ2 и применением поправочного коэффициента Бонферрони для множественных сравнений. Полученные значения р обозначались как рб и частоты кластеров признавались различными с доверительным интервалом 5% (рб<0,05). Относительный риск (отношение шансов, OR, odds ratio) при сравнении групп больных с контрольной группой оценивали как вероятность попадания носителя того или иного аллеля/генотипа в группу больных с 95% доверительным интервалом (CI 95%).

Результаты и обсуждение

По результатам генотипирования были получены показатели абсолютной и относительной частоты аллелей (L и H) и генотипов (LL, LH, HH) по полиморфному локусу Val158Met гена СОМТ в группах сравнения (табл. 2, 3).

Отклонений от равновесия Харди—Вайнберга в диагностических когортах и контрольной группе не выявлено. Частоты аллелей и генотипов в группе контроля не отличались от средних для европейской популяции.

На первом этапе сравнивали диагностические когорты пациентов с контрольной группой и между собой, далее внутри когорт проводилось сравнение групп с разной степенью отягощенности с контрольной группой, после чего сравнивали неотягощенных пациентов с отягощенными и подгруппами с разной степенью отягощенности. Дополнительно проводили сравнение подгрупп со средней и высокой степенью отягощенности между собой. Далее сравнивали группы больных с одинаковой степенью отягощенности из разных диагностических когорт.

Алкоголизм. В группе больных алкоголизмом было выявлено незначительное повышение частоты генотипа LL по сравнению с контролем (32,15 и 25,46%), не достигающее статистической значимости (рб=0,09). Ряд авторов [11, 22] сообщали о достоверном превалировании не только генотипа LL, но и L аллеля у больных алкоголизмом в смешанной группе мужчин и женщин. В то же время другие исследователи [10, 12] подобной ассоциации не подтвердили. Эти противоречия можно обьяснить клинической гетерогенностью группы больных алкоголизмом, в том числе по полу и этническому происхождению.

В группе больных с высокой степенью отягощенности (FH2) по сравнению с контролем обнаружено достоверное превалирование L аллеля (65,09 и 52,15%, р=0,001, χ2=10,85 (df=1), OR=1,71 [CI 95% 1,24; 2,35] и значительное достоверное снижение частоты генотипа НН (7,55 и 21,17%, рб=0,003, χ2=10,13 (df=1), OR=3,13 [CI 95% 1,48; 6,62]). В этой же группе по сравнению с неотягощенными больными (FH0) выявлено достоверное повышение частоты аллеля L (65,09 и 55,22%, р=0,034, χ2=4,48 (df=1), OR=1,51 [CI 95% 1,03; 2,21], подобные результаты обнаружены и при сравнении с группой больных со средней степенью отягощенности (FH1): 65,09 и 49,28% (рб=0,0005, χ2=12,21(df=1), OR=1,91 [CI 95% 1,33; 2,76]). Вероятно, низкоактивный аллель L связан с степенью отягощенности, его частота нарастает параллельно увеличению степени отягощенности, и он может считаться достоверным маркером предрасположенности, по крайней мере у больных алкоголизмом. В то же время в нашем исследовании не была подтверждена связь генотипа LL с отягощенностью по алкоголизму (это согласуется с данными по финской популяции [19]). Больные с высокой степенью отягощенности оказались также единственной группой, в которой резко снижена частота генотипа НН. Можно предполагать, что накопление алкоголизма в семье неким образом связано с элиминацией гомозигот по высокоактивному аллелю гена СОМТ. Учитывая значительные клинические отличия течения алкоголизма у отягощенных больных, особенно с высокой степенью отягощенности (ранний возраст манифестации, высокая прогредиентность течения), велика вероятность связи НН генотипа

с «легким» течением болезни, которая может быть выявлена в дальнейших исследованиях специфических клинических фенотипов.

Героиновая наркомания. Диагностическая когорта больных наркоманией не отличалась от контрольной группы. Мы не подтвердили сообщения ряда авторов о возможном превалировании высокоактивного аллеля Н и генотипа НН среди групп больных с зависимостью от опиатов [9, 20], что согласуется с результатами, полученными в корейской популяции [4]. Было выявлено снижение частоты генотипа НН у больных со средней степенью отягощенности по сравнению с неотягощенными больными (13,24 и 27,5%), достоверность различий на границе значимости (рб=0,058). У больных с высокой степенью отягощенности по сравнению с больными со средней степенью достоверно снижена частота генотипа LH (38,78 и 61,76%, рб=0,0028, χ2=6,03 (df=1), OR=2,51 [CI 95% 1,19; 5,3].Это свидетельствует, что больные наркоманией близки к контрольной группе, однако среди них выявляется снижение частоты генотипа НН у больных с отягощенностью по сравнению с неотягощенными. Возможно, стертая картина сдвига частот в этой когорте вызвана достоверно большим числом неотягощенных больных по сравнению с больными алкоголизмом, а также высокой наркогенностью героина, что обеспечивает относительно высокую долю больных без предрасположенности среди наркоманов.

Исходные группы больных и группы отягощенных и неотягощенных больных достоверно не различались по частоте аллелей и генотипов, что можно считать доказательством генотипического единства зависимости от двух разных ПАВ. Однако при сравнении групп больных из

разных групп пациентов с одинаковой степенью отягощенности был обнаружен ряд различий: у больных со средней степенью: 2-кратное снижение частоты генотипа НН у больных наркоманией (13,24%) по сравнению с больными алкоголизмом (28,78%, рб=0,027, χ2=6,1 (df=1), OR=2,55 [CI 95% 1,17; 5,54]); у больных с высокой степенью — повышение частоты аллеля L (65,09 и 52,04%), р=0,028, χ2=4,8 (df=1), OR=1,71 [CI 95% 1,06; 2,78] и резкое снижение частоты генотипа НН (7,55 и 28,57%, рб=0,001, χ2=12,16 (df=1), OR=4,73 [CI 95% 1,87; 11,99] у больных алкоголизмом по сравнению с больными героиновой наркоманией. Дальнейшие исследования взаимосвязи генотипов по локусу Val158Met гена СОМТ с клиническим фенотипами аддикции могли бы обьяснить обнаруженные факты. Показательно, что разделение больных по степени отягощенности выявило скрытые генотипические различия между пациентами с разными диагнозами. Отмечают [8], что носители НН генотипа характеризуются повышенной реактивностью лимбической системы на негативные эмоциональные стимулы. Возможно, различия между больными из основных групп, выявленные при сравнении групп с одинаковой степенью отягощенности, связаны с мотивационными характеристиками выбора ПАВ (алкоголь или героин) в момент начала злоупотребления и манифестации болезни.

В целях верификации данных, полученных о связи вариантов генотипов со степенью семейной отягощенности, был проведен обратный (реверсивный) анализ распределения степени отягощенности в генотипических группах (геногруппах) пациентов. Геногруппы формировали по факту выявления носительства определенного генотипа по полиморфному локусу Val158Met гена СОМТ.

блемы генетики зависимости от психоактивных веществ. Наркология 2004; 6: 76—83.

2.Анохина И.П., Кибитов А.О., Шамакина И.Ю. Генетика зависимости от психоактивных веществ. Наркология Национальное руководство. М: Гэотар-Медиа 2008; 52—84.

methyltransferase gene polymorphism in Korean male alcoholics. Psychiat Genet 2005; 15: 2: 151—154.

13.Mattay V.S., Goldberg T.E., Fera F. et al. Catechol O-methyltransferase Val158-met genotype and individual variation in the brain response to amphetamine. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 10: 6186—6191.

O-methyltransferase gene. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 2003;

20:2: 127—130.

5.Cloninger C.R., Sigvardsson S., Gilligan S.B. et al. Genetic heterogeneity and the classification of alcoholism. Adv Alcohol Subst Abuse 1988; 7: 3—4: 3—16.

6.Comings D.E., Blum K. Reward deficiency syndrome: genetic aspects of behavioral disorders. Prog Brain Res 2000; 126: 325—341.

7.Dawson D.A., Harford T.C., Grant B.F. Family history as a predictor of alcohol dependence. Alcohol Clin Exp Res 1992; 16: 3: 572—575.

8.Heinz A., Smolka M.N. The effects of catechol O-methyltransferase genotype on brain activation elicited by affective stimuli and cognitive tasks. Rev Neurosci 2006; 17: 3: 359—367.

9.Horowitz R., Kotler M., Shufman E. et al. Confirmation of an excess of the high enzyme activity COMT val allele in heroin addicts in a family-based haplotype relative risk study. Am J Med Genet 2000; 96: 5: 599—603.

10.Ishiguro H., Haruo Shibuya T., Toru M. et al. Association study between high and low activity polymorphism of catechol-O-methyltransferase gene and alcoholism. Psychiat Genet 1999; 9: 3: 135—138.

11.Kauhanen J., Hallikainen T., Tuomainen T.P. et al. Association between the functional polymorphism of catechol-O-methyltransferase gene and alcohol consumption among social drinkers. Alcohol Clin Exp Res 2000;

24:2: 135—139.

1996; 1: 4: 333—348.

16.Rothhammer F., Rothhammer P., Llop E. Genetics of addictive disorders. Rev Med Chil 2000; 128: 11: 1279—1282.

17.Schuckit M.A. Twin studies in substance abuse: An overview. Twin research

3.Epidemiological and Clinical studies. New York: Alan R Liss Inc 1981; 68—71.

18.Sery O., Didden W., Mikes V. et al. The association between high-activity COMT allele and alcoholism. Neuro Endocrinol Lett 2006; 27: 1—2: 231—

19.Tiihonen J., Hallikainen T., Lachman H. et al. Association between the functional variant of the catechol-O-methyltransferase (COMT) gene and type 1 alcoholism. Mol Psychiat 1999; 4: 3: 286—289.

20.Vandenbergh D.J., Rodriguez L.A., Miller I.T. et al. High-activity catechol- O-methyltransferase allele is more prevalent in polysubstance abusers. Am J Med Genet 1997; 74: 4: 439—442.

21.Vanyukov M.M., Tarter R.E. Genetic studies of substance abuse. Drug and Alcohol Dependence 2000; 59: 101—123.

22.Wang T., Franke P., Neidt H. et al. Association study of the low-activity allele of catechol-O-methyltransferase and alcoholism using a family-based approach. Mol Psychiat 2001; 6: 1: 109—111.