Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Руководство к Практическим Занятиям Микробиологии.doc
Скачиваний:
5063
Добавлен:
19.06.2017
Размер:
8.01 Mб
Скачать

Фенотипическая изменчивость бактерий

Временные, наследственно не закрепленные изменения называются модификациями. Модификации также контролируются геномом бактерий, но (в отличие от мутаций) не сопровождаются изменениями кодирующей структуры и быстро утрачиваются. Чаще всего у бактерий отмечаютсяморфологические(приводящие к обратимым изменениям формы) ибиохимические (проявляются индуцибельным синтезом некоторых продуктов, чаще ферментов) модификации. Модификации возникают как адаптивные реакции бактериальных клеток на изменения окружающей среды, что позволяет им быстро приспосабливаться и сохранять численность популяции на жизнеспособном уровне. После устранения соответствующего воздействия, вызвавшего их образование, бактерии возвращаются к исходному фенотипу.

Стандартное проявление модификации – разделение однородной популяции на несколько типов. Этот феномен получил название диссоциация микробов. Обычно диссоциации возникают в условиях, неблагоприятных для исходной популяции. Примером диссоциации может служить изменение вида и структуры бактериальных колоний на твердых питательных средах. Для обозначения диссоциирующих колоний используют первые буквы английских названий:S-колонии(отангл. smooth– гладкий);R-колонии(отангл. rough– шероховатый);М-колонии(отангл. mucoid– слизистый) иD-колонии(отангл. dwarf– карликовый). Диссоциации сопровождаются изменениями биохимических, морфологических, антигенных и патогенных свойств возбудителей.

Изменение фенотипа следует считать модификацией, если выполняются три основных условия: 1) определенность (связь изменения фенотипа с определенным фактором); 2) общность изменений в популяции; 3) обратимость (восстановление признака после прекращения действия фактора).

Методы изучения генетики бактерий

Выявление фенотипической изменчивости (модификации).При посевеProteus mirabilisна питательный агар вырастают колонии протея, окруженные зоной «роения». При пересеве колоний петлей на поверхность питательного агара с 1% сухой желчью зоны роения исчезают, а при пересеве на обычный питательный агар все колонии вновь окружены зоной роения.

Определение Col-плазмид (колициногенных факторов).Исследуемые культурыE.coliзасевают методом укола в питательный агар в чашку Петри (по 7-8 уколов на 1 чашку). Посевы инкубируют при 370С сутки и на внутреннюю поверхность чашки помещают кусочек ваты, смоченный хлороформом, в парах которого бактерии погибают. Затем поверхность агара равномерно заливают 3 мл расплавленного и остуженного до 450С полужидкого (0,7%) питательного агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной индикаторной культуры (наиболее чувствительной к данному типу колицина). Результат учитывают через 18-24 ч инкубации при 370С: вокруг посевов культур, продуцирующих колицины, появляются зоны подавления роста индикаторного штамма.

Определение колицинотипа.В чашку Петри в питательный агар засевают эталонные штаммы бактерий с известным колицинотипом и инкубируют при 370С сутки, после чего бактерии убивают в парах хлороформа. По поверхности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного и остуженного полужидкого агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной культурыE.coliнеизвестного колицинотипа. Результаты учитывают через 18-24 ч. Если колицинотип индикаторной культуры и исследуемого штамма совпадут, то зоны подавления роста вокруг эталонного штамма не будет.

Тест перераспределения для выявления спонтанности мутаций.В две чашки Петри с питательным агаром вносят по 0,1 мл суточной культурыE.coliМ17 и распределяют равномерно по поверхности питательной среды. Через 6 ч инкубации при 370С в одной из чашек перераспределяют шпателем выросшие микроколонии. Через 24 ч из каждой чашки культуры пересевают методом отпечатков на поверхность питательного агара с рифампицином. Через 24 ч инкубации учитывают результат: на поверхности среды с рифампицином в чашке без перераспределения выросли единичные колонии рифампицинрезистентных мутантов, а в чашке с перераспределением выросли более многочисленные (в десятки – сотни раз) колонии антибиотикоустойчивых мутантов.

Данный опыт показывает, что антибиотикоустойчивые мутанты возникли спонтанно, до контакта бактерий с селективным агентом – рифампицином. Уже через 6 ч на среде без антибиотика появляются микроколонии антибиотикоустойчивых мутантов. Благодаря перераспределению бактерии мутанты из этих микроколоний распространяются по всей поверхности среды и после посева отпечатками на среду с антибиотиками дадут начало многочисленным колониям мутантов, в то время как отпечатки с чашки без перераспределения выявляют только небольшое число колоний, соответственно исходным микроколониям мутантов.

Индукция мутаций под действием ультрафиолетового (УФ) облучения.В качестве источника УФ-лучей используют бактерицидную лампу ВУФ-15, которую устанавливают на расстоянии 60 см от центра облучаемого объекта.

Для получения lac-мутантовE.coliпредварительно выращивают на питательном бульоне в течение 14-18 ч. Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 моль раствораMgSО4и охлаждают на льду для прекращения деления клеток. Суспензию помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15-150 сек (предварительно определяют оптимальную мутагенную дозу, равную 0,1-1% от числа выживших бактерий), после чего клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в питательном бульоне. Пробирку с бульоном инкубируют при 370С в течение 14-18 ч. Разведения 10-2– 10-5по 0,1 мл высевают на среду Эндо. Параллельно делают контрольные посевы.lac-мутантыE.coliна среде Эндо образуют бесцветные колонии.

Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм E.coliВ или К12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика. Параллельно делают контрольные посевы. КлеткиE.coli, выросшие на этой среде является антибиотикорезистентными.

Постановка опыта конъюгации.Донор штаммE.coliК12Hfrleu+Strs. Реципиент – штаммE.coli К12FˉleuˉStrr. Селективная среда – минимальная глюкозосолевая среда со стрептомицином.

К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора и инкубируют 30 мин при 370С. Затем смесь разводят до 10-2– 10-3и высевают по 0,1 мл на селективную среду в чашки Петри, где вырастут только рекомбинанты. В качестве контроля на среду сеют донорский и реципиентный штаммы, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй – ауксотроф по лейцину. После подстчета выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.

Постановка опыта трансформации.Реципиент – штаммBacillus subtilis Strs(сенная палочка, чувствительная к стрептомицину). Донор – ДНК, выделенная из штаммаB. subtilis Strr(устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) – питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.

К 1 мл бульонной культуры B. subtilisдобавляют 1 мл ДНК донора и инкубируют 30 мин при 370С. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов 0,1 мл смеси высевают на селективную среду. Частоту трансформации определяют по отношению количества выросших колоний рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма.

Постановка опыта специфической трансдукции.Реципиент – штаммE.coli lac‾, лишенный β-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг – фагλ dgal, в геноме которого часть генов замещена β-галактозидазным оперономE.coli. Селективная среда – среда Эндо, на которой лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного штамма – ярко малиновые с металлическим оттенком.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуре реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага в концентрации 106– 107частиц в 1 мл. Смесь инкубируют 60 мин при 370С и готовят ряд десятикратных разведений. Из пробирки с 10-6разведением по 0,1 мл культуры высевают на три чашки со средой Эндо и инкубируют в течение суток. Величину трансдукции вычисляют по отношению количества клеток рекомбинантов, обнаруженных на всех чашках к числу клеток реципиентного штамма.