- •Руководство
- •Основные этапы развития микробиологии
- •Принципы организации и оборудования микробиологической лаборатории, правила работы в ней
- •Раздел . Морфология микроорганизмов
- •Клеточная стенка
- •Химический состав клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных прокариот
- •Цитоплазматическая мембрана
- •Периплазматическое пространство
- •Мезосомы
- •Цитоплазма
- •Метод окраски по Нейссеру
- •Нуклеоид
- •Капсула
- •Жгутики
- •Ворсинки (фимбрии, пили)
- •Светлопольная микроскопия
- •Темнопольная микроскопия
- •Фазовоконтрастная микроскопия
- •Люминесцентная микроскопия
- •Электронная микроскопия
- •Питание бактерий
- •Питание бактерий
- •Питательные среды
- •Условия культивирования бактерий
- •Дыхание бактерий
- •Дыхание бактерий
- •Ферменты бактерий
- •Культуральные свойства бактерий
- •Выделение чистых культур микроорганизмов
- •Особенности культивирования отдельных групп прокариот
- •Действие физических факторов на микроорганизмы
- •Методы стерилизации
- •Действие химических факторов на микроорганизмы
- •Раздел III. Экология микроорганизмов
- •Микрофлора почвы
- •Санитарно-бактериологическое исследование почвы
- •Микрофлора воды
- •Санитарно-бактериологическое исследование воды
- •Нормативы качества питьевой воды
- •Микрофлора воздуха
- •Санитарно-бактериологическое исследование воздуха
- •Критерии оценки воздуха жилых помещений
- •Критерии оценки воздуха лечебно-профилактических учреждений
- •Микрофлора организма человека
- •Микрофлора кожи
- •Санитарно-бактериологическое исследование кожи
- •Микрофлора полости рта
- •Микрофлора желудочно-кишечного тракта
- •Микрофлора дыхательных путей
- •Микрофлора конъюнктивы
- •Микрофлора уха
- •Микрофлора мочеполовой системы
- •Значение нормальной микрофлоры организма человека
- •Дисбиоз
- •Микрофлора пищевых продуктов
- •Санитарно-бактериологическое исследование пищевых продуктов
- •Микрофлора лекарственных растений, лекарственного сырья и готовых лекарств
- •Микрофлора растительного лекарственного сырья
- •Микрофлора готовых лекарственных форм
- •Санитарно-бактериологические методы исследования в аптеках
- •Санитарная микробиология, её задачи
- •Влияние биологических факторов на микроорганизмы
- •Раздел IV. Генетика микроорганизмов Генетическая система бактерий
- •Репликация бактериальной днк
- •Транскрипция
- •Регуляция выражения генетической информации у бактерий
- •Перенос генетического материала бактерий
- •Генетическая изменчивость бактерий
- •Фенотипическая изменчивость бактерий
- •Методы изучения генетики бактерий
- •Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний
- •Зонд с меткой
- •Раздел V. Инфекция Инфекция. Факторы инфекционного процесса. Основные формы инфекции
- •Основные источники инфекции. Пути и способы заражения. Ворота инфекции.
- •Периоды инфекционного процесса.
- •Понятие о патогенности и вирулентности бактерий. Токсины.
- •Моделирование инфекционного процесса на лабораторных животных.
- •Раздел VI. Иммунология инфекционного процесса Общая характеристика, виды и формы иммунитета
- •Факторы и механизмы неспецифической противоинфекционной защиты
- •Слизистые оболочки
- •Лимфатические узлы
- •Воспаление. Фагоцитоз
- •Гуморальные факторы и методы их определения
- •Нормальные антитела
- •Комплемент
- •Мембраноатакующий комплекс
- •Пропердин
- •Лизоцим
- •Бактерицидная активность сыворотки
- •Интерферон
- •2,5-Олигоадени-
- •Антигены
- •Методы дезинтеграции микробов
- •Методы выделения клеточных компонентов
- •Антитела
- •Генетический контроль биосинтеза антител
- •Клеточная кооперация в иммунном ответе
- •Процессинг и презентация антигена
- •Корецепторы межклеточных взаимодействий
- •Клеточный тип иммунного ответа
- •Гуморальный (антительный) тип иммунного ответа
- •Особенности иммунитета при бактериальных, грибковых и протозойных инфекциях Антибактериальный иммунитет
- •Особенности иммунитета при грибковых заболеваниях
- •Особенности иммунитета при протозойных заболеваниях
- •Серологические методы исследования
- •Реакция агглютинации (ра)
- •Реакция преципитации (рп)
- •Реакция кольцепреципитации
- •Радиальная иммунодиффузия по Манчини
- •Реакция иммуноэлектрофореза (иэф)
- •Реакция связывания комплемента (рск)
- •Реакция непрямой гемагглютинации(рнга)
- •Реакция гемагглютинации (рга) и реакция торможения гемагглютинации (ртга)
- •Реакция иммунофлуоресценции (риф)
- •Радиоиммунологический анализ (риа)
- •Иммуноферментный метод (ифа)
- •Раздел VII. Основы вирусологии Морфология и методы исследования вирусов
- •Кислота
- •Физиология вирусов
- •Цитоплазма
- •Методы культивирования и индикации вирусов
- •Генетика вирусов
- •Противовирусный иммунитет
Антитела
Антитела представляют собой белки глобулиновой природы (иммуноглобулины) образующиеся в организме под воздействием антигена и обладающие способностью избирательно связываться с ним. Существуют пять разновидностей молекул (классов) иммуноглобулинов с молекулярной массой от 150 до 900 тыс. дальтон: IgM, lgG, IgA, IgE, IgD. Молекулы иммуноглобулинов состоят из двух легких (L) и двух тяжелых (Н) полипептидных цепей, соединенных между собой дисульфидными связями (рис. 33). Оба типа цепей, соединенных между собой, обладают антигенностью. У тяжелых цепей она специфична для каждого класса иммуноглобулинов и соответственно классам Н-цепи обозначаются ,,,,. Легкие цепи в антигенном отношении делятся на две разновидности —и, одинаковые для, разных классов. Антигенные различия тяжелых цепей используют для получения антисывороток, позволяющих выявить наличие в исследуемом материале иммуноглобулинов того или иного класса. Легкие цепи IgG состоят из двух участков (доменов): вариабельных (VL) и константных (CL). Тяжелые цепи включают в себя один вариабельный (VН) и 3 константных участка (CH1, CH2, СН3). Вариабельные участки легких и тяжелых цепей формируют активные центры антител (VL –VH). Участок CL – CH1определяет небольшие различия в последовательности расположения аминокислот у индивидуумов одного и того же вида (аллоантигенные различия молекул IgM). Область СН2–СН2участвует в фиксации и активации комплемента, а область СН3–СН3– в фиксации антитела к клеткам (лимфоцитам, макрофагам, тучным клеткам). Данный тип строения молекулы характерен и для всех остальных классов иммуноглобулинов, различия заключаются в дополнительной организации этой основной единицы. Так, Н-цепь IgM состоит не из 4, а из 5 доменов, а вся молекула IgM представляет собой пентамер молекулы IgG, соединенный дополнительными полипептидными J-цепями. IgA может быть в форме мономеров, димеров и секреторного IgA. Последние две формы имеют дополнительные (димеры) J или J и S цепи (секреторный). Другие свойства антител представлены в таблице 13.
Молекула антитела связывается с детерминантой антигена не целиком, а лишь определенной своей частью, называемой активным центром. Активный центр представляет собой полость или щель, соответствующую пространственной конфигурации детерминантной группы антигена. Один из активных центров по разным причинам может быть функционально инертным. Такие антитела называются неполными. Их появлению обычно предшествует образование полных, т. е. антител с двумя (IgG) активными центрами. Неполные антитела встречаются у разных классов иммуноглобулинов.
О
Рис.
. Структура молекулы IgG
с указанием мест расщепления на фрагменты
2-меркапэтанолом, папаином и пепсином.
Таблица 13
Основные характеристики иммуноглобулинов человека
№ п/п |
Показатели
|
IgM |
IgG |
IgA |
IgE |
IgD |
1.
2. 3. 4. 5. 6.
7. 8. 9. |
Молекулярная масса
Уровень в крови в г/л Тип тяжелых цепей Формула Фиксация С Нейтрализация токсинов Агглютинация Бактериолиз Прохождение плаценты |
900т.
0,5 – 1,8 1 - 2 5H5L ++++ +
+ + – |
150т.
6 –16 1 - 4 2H2L ++ +
+ + + |
170т. и 300т. 1 – 5 1 - 2 4H4L +S +
+ ? –
|
190т.
0,00002 2H2L – –
– – –
|
180т.
0,03 – 0,04 2H2L – –
– – –
|
Территориально эти клетки располагаются в селезенке, лимфоузлах, костном мозге, лимфоидных образованиях слизистых оболочек.
При первичном контакте организма с антигеном и антителообразовании различают индуктивную и продуктивные фазы. Продолжительность первой фазы составляет около 2 суток. В этот период происходит пролиферация и дифференцировка лимфоидных клеток, развитие плазмобластической реакции. Вслед за индуктивной наступает продуктивная фаза. В сыворотке крови антитела начинают определяться с З-го дня после контакта с антигеном. Эти антитела относятся к классу IgM. С 5–7 дня происходит постепенная смена синтеза IgM на синтез IgG той же специфичности. Обычно к 12—15 дню кривая антителообразования достигает максимума, далее уровень антител начинает снижаться, но определенное их количество можно обнаружить и через много месяцев, а иногда и лет. При повторном контакте организма с тем же антигеном индуктивная фаза занимает лишь несколько часов. Продуктивная фаза протекает быстрее и интенсивнее, осуществляется синтез преимущественно IgG.
Для выделения и очистки молекул иммуноглобулинов применяют хроматографический и электрофоретический методы с предшествующим первичным фракционированием исходной многокомпонентной смеси (сыворотки крови человека, иммунизированного животного) путем избирательного осаждения молекул одного или нескольких видов.
Фракционирование осаждением основано на различной растворимости биополимеров (глобулинов) в водных растворах, которая определяется наличием и соотношением гидрофобных и гидрофильных группировок в их структуре. Белки, несущие на поверхности значительное количество гидрофобных аминокислотных остатков, например глобулины, плохо растворимы в водной среде с низкой ионной силой, а белки, характеризующиеся низкой гидрофобностью (альбумины), обладают высокой растворимостью в воде. С увеличением ионной силы раствора, в котором находятся глобулины, их растворимость повышается, однако по достижении определенного предела концентрации они начинают агрегировать и выпадать в осадок. Происходит солевое осаждение молекул — высаливание. Так как глобулины разных классов отличаются друг от друга по характеру растворимости при высоких концентрациях соли, то постепенно увеличивая ионную силу раствора, в котором находятся различные молекулы, можно последовательно перевести их в нерастворимое состояние — высолить. Эффективными солями для осаждения иммуноглобулинов являются сульфаты и фосфаты, цитраты натрия, калия и аммония. Из органических растворителей для фракционирования иммуноглобулинов больших размеров чаще всего используют этанол и риванол. В последние годы для осаждения сывороточных белков используют водорастворимые полимеры — полиэтиленгликоль и сульфат декстрана. Так, для осаждения IgM применяют 6% концентрацию полиэтиленгликоля, для осаждения IgG — 12% и для осаждения IgA — 14% концентрацию.
Отдельные глобулины, перешедшие под воздействием различных реагентов в нерастворимое состояние, представляют собой достаточно крупные агрегаты, которые можно отделить от раствора фильтрованием. В современных биологических исследованиях широко используют фильтры из стекловолокна, асбеста, нитроцеллюлозы, ацетатцеллюлозы, целлюлозы, тефлона, нейлона, капрона, поливинилхлорида и др.
Полученные фракции иммуноглобулинов обычно подвергают более тонкой очистке хроматографией или электрофорезом. К настоящему времени разработаны различные виды. хроматографии, среди которых наиболее распространены гель-фильтрация, ионообменная и аффинная. Существует множество приемов применения каждого из видов хроматографии — колоночная, в тонких слоях и т. д. Гранулами набухшего в каком-либо растворителе геля с пористой структурой наполняют колонки, наслаивают сверху на столб геля осажденную фракцию иммуноглобулинов с разными молекулярными массами и пропускают их через гель. Поскольку гранулы геля имеют пористую структуру, то часть молекул, размеры которых меньше величины пор, проникают в гранулы и мигрируют определенное время в их сетчатой структуре. Молекулы, размеры которых больше величины пор, не проникают в гранулы, а, огибая их, продвигаются быстрее. В результате молекулы глобулинов элюируются из хроматографической колонки поочередно — в порядке уменьшения их молекулярных масс. Субфракции глобулинов с разной молекулярной массой собирают раздельно. Для гельфильтрации применяют три вида гранулированных гелей: декстрановые (сефадекс типов от G-10-грубый до G-200-сверхтонкий), агарозы (сефарозы) полиакриламидные (биогели, акрилексы). В основе метода ионообменной хроматографии лежит применение носителей, состоящих из нерастворимой основы (гели декстрана, агарозы, полиакриламида) с фиксированными на ней функциональными группами (сульфометильными, сульфоэтильными, сульфопропильными, карбоксиметильными или карбоксиэтильными и др. катионов). При пропускании через ионообменник с положительно заряженными, функциональными группами (катионообменник) смеси глобулинов, имеющих отрицательный, заряд, последние свяжутся с ними. Связавшиеся глобулины отличаются между собой изоэлектрическими точками, и их можно затем в определенной последовательности элюировать из ионообменника. Принцип иммуноаффинной хроматографии заключается в том, что на носителе (агароза, целлюлоза, гели сефадекса или полиакриламида, бентонит и др.) сорбируют функционально активные молекулы антигенов. При пропускании через такой иммуносорбент фракций иммуноглобулинов произойдет образование комплекса носитель-антиген-иммуноглобулин. В последующем комплекс диссоциируют для получения чистой фракции иммуноглобулина. Иммуносорбент используют многократно.
Разделение классов глобулинов проводят также с использованием метода электрофореза, так как их электрофоретическая подвижность различна.