Заключение

В данной диссертации проведено улучшение метода дискретных диполей (МДД) как в скорости, так и в надёжности, что позволяет моделировать светорассеяние практическими любыми биологическими клетками. С помощью этого метода моделировались индикатрисы клеток крови, измеряемые сканирующим проточным цитометром (СПЦ). Был разработан метод характеризации нативных эритроцитов по измеренным индикатрисам. Была исследована модель гранулоцита в виде зернистого шара, которая объясняет известные экспериментальные данные. Было проведено экспериментальное исследование нейтрофилов с помощью СПЦ и обсуждены различные подходы к решению обратной задачи светорассеяния.

Развитие метода дискретных диполей

Мы провели строгий теоретический анализ сходимости МДД. В области применимости МДД (kd < 2) ошибки ограничены суммой членов линейных и квадратичных по параметру дискретизации y, при этом линейный член существенно меньше для кубовидных чем для некубовидных рассеивателей. Относительная важность линейного члена убывает с увеличением размера, поэтому сходимость МДД для достаточно больших частиц квадратична в типичном диапазоне y. Все эти выводы были подтверждены обширным численным моделированием.

Более того моделирование показало, что ошибки не только ограниченны квадратичной функцией, но и могут быть (с хорошей точностью) описаны квадратичной функцией от y. На основании этого факта мы предложили методику экстраполяции для улучшения точности МДД. Эмпирическое изучение эффективности этой методики показало, что она заметно подавляет максимальные ошибки S11(θ ),

когда параметр наилучшей дискретизации ymin < 0.4 и 0.15 для кубовидных и некубовидных рассеивателей соответственно (при показателе преломления m = 1.5). Качество экстраполяции улучшается с уменьшением ymin, достигая выдающихся результатов, особенно для кубовидных частиц, – уменьшение ошибки более чем на два порядка при ymin ≈ 0.05 для рассеивателей порядка длины волны с m = 1.5.

Мы предложили оценку погрешности экстраполяции и показали её надёжность. Эта оценка полностью внутренняя, следовательно она потенциально позволяет создать адаптивный МДД – программу, автоматически улучшающую дискретизацию до достижения заданной точности. Также предложен прямой метод разделить ошибки формы и дискретизации. В частности, максимальные ошибки S11(θ ) для шара с kD = 10

194

порядок быстрее при m ≤ 1.2 и x > 30, в то время как при m ≥ 1.7 КРВО быстрее в той же степени, а при m = 1.4 методы сравнимы. Рассмотренные примеры биологических клеток согласуются с выводами для шаров.

Можно заключить, что МДД, и компьютерная программа ADDA в частности, особенно подходит для моделирования светорассеяния биологическими клетками с показателем преломления близким к единице. Методика экстраполяции и внутренняя ошибка погрешности делают МДД точным и надёжным, однако возможно дальнейшее улучшение МДД, особенно для бóльших показателей преломления. Они могут включать уменьшение ошибок формы, а также улучшение поляризуемости и члена взаимодействия для уменьшения ошибок дискретизации. Предобусловливание матрицы взаимодействия МДД должно быть исследовано для уменьшения времени моделирования и доступности бóльших x и m. Также требуется систематически исследовать эффективность МДД для комплексных m.

Характеризация эритроцитов с помощью сканирующего проточного цитометра

Мы показали, что популярные приближения нативной формы эритроцита сплюснутыми сфероидами и шаровыми дисками в целом неудовлетворительны для точного моделирования индикатрис эритроцитов, кроме нескольких частных случаев. Поэтому мы использовали МДД для строгого моделирования светорассеяния нативными эритроцитами. Мы предложили расширенную четырёхпараметрическую модель формы эритроцита, в которой все величины, полученные микроскопическими измерениями, являются независимыми входными параметрами. Мы вычислили 40 000 индикатрис эритроцитов, случайно выбирая шесть параметров: четыре параметра формы, концентрацию гемоглобина HbC и угол ориентации β, из интервалов, соответствующим литературным данным по здоровым человеческим эритроцитам. Для решения обратной задачи светорассеяния мы разработали χ2 метод, основанный на прямом сравнении экспериментальных индикатрис с теоретическими из насчитанной базы данных. Мы проверили две модификации этого метода.

Мы использовали χ2 метод для характеризации эритроцитов в пробе крови, полностью определяя их форму, HbC и ориентацию в капилляре СПЦ. Результаты для объёма и HbC были сравнены с другими методами – средние значения совпадают, но стандартные отклонения результатов χ2 метода примерно в 1.5 раза больше чем для эталонных методов. Результаты для всех параметров разумные, за исключением минимальной толщины, которая не может быть точно определена χ2 методом, ввиду

196

низкой чувствительности индикатрисы к этому параметру. Мы показали, что ориентация эритроцитов в потоке СПЦ практически всегда попадает в интервал

β [80°,90°] (диаметр вдоль потока) в согласии с предыдущими оценками на основе гидродинамических вычислений и приближённого моделировании светорассеяния.

Мы также использовали базу данных вычисленных индикатрис для уточнения и проверки ранее предложенного эмпирического метода определения диаметра эритроцита D по положению последнего пика в амплитудном спектре Фурье модифицированной индикатрисы. Коэффициент пропорциональности, определённый линейной подгонкой для модельных данных, составляет 28.643 мкм градус (при длине волны 0.66 мкм и показателе преломления внешней среды 1.337). Применительно к той же пробе крови спектральный метод приводит к более широкому распределению по диаметру чем χ2 метод, также есть систематическая разница примерно 0.5 мкм между этими методами. Следовательно требуется дальнейшее улучшение обоих методов, а для проверки их точности необходим эталонный метод, например, на основе микроскопических измерений.

Хотя мы и показали, что вышеописанный метод характеризации приводит к разумным результатам, и средние значения согласуются с надёжными эталонными методами, определённо требуется дальнейшая работа, прежде чем внедрять его в клиническую практику. Эта работа включает улучшение скорости и точности χ2 метода, а также его надёжности и контроля экспериментальных ошибок. Можно использовать χ2 метод совместно со спектральным методом для более точного определения диаметра эритроцита. В завершение, необходимо провести дополнительную проверку на многих пробах крови, сравнивая результаты с эталонными методами, в том числе и микроскопическими.

Поскольку метод характеризации одновременно определяет шесть параметров для каждого эритроцита, он очень чувствителен к ошибкам как моделирования, так и измерений. Поэтому дальнейшее развитие требует прогресса в трёх областях: моделировании светорассеяния, экспериментальном измерении индикатрисы и математике, связанной с процедурой обращения и задачей многопараметрической оптимизации. Всё это значительно усложняет задачу, но её решение позволит существенно повысить точность и информативность клинического анализа эритроцитов на проточном цитометре.

197