3.3.Характеризация морфологии нативных эритроцитов с помощью сканирующего проточного цитометра

Вэтом разделе приведены последние результаты по характеризации эритроцитов в экспериментах на сканирующем проточном цитометре с помощью масштабного МДД моделирования. В подразделе 3.3.1 представлена расширенная четырёхпараметрическая модель формы эритроцита, на основе которой были вычислены 40 000 индикатрис, случайно варьируя параметры формы, концентрацию гемоглобина (HbC) и угол ориентации β (см. подраздел 3.3.2). Для решения обратной задачи светорассеяния мы развили χ2 метод, основанный на прямом сравнении экспериментальны индикатрис с теоретическими из базы данных (подраздел 3.3.3). Мы применили этот метод к одной пробе крови в подразделе 3.3.4 и сравнили результаты для объёма эритроцита и HbC с другими методами. Средние значения хорошо

согласуются, однако стандартные отклонения для χ2 метода примерно в 1.5 раза больше чем для эталонных методов. Также, используя базу данных, мы уточнили ранее предложенный спектральный метод определения диаметров эритроцитов в подразделе 3.3.5. Для той же пробы распределение по диаметру, определённому спектральным методом, было даже шире чем для χ2 метода. Более того, имеется систематическая разница в 0.5 мкм между этими методами. Следовательно оба метода требуют дальнейшего улучшения, при этом необходимо использовать эталонный метод, основанный, например, на микроскопических измерениях. В завершение мы обсуждаем чувствительность обоих методов к экспериментальным ошибкам и направление дальнейших исследований в подразделе 3.3.6.

3.3.1. Расширенная модель формы эритроцита

Основным ограничением модели формы (176) является невозможность независимого изменения b и h. Поэтому мы искали модель, способную описывать экспериментально измеренные формы [см. формулу (173)] и содержащую b и h как входные параметры. Была построена следующая модель:

что является моделью Кюхеля (Kuchel) и Фэкерела (Fackerell) [205], к которой добавлен коэффициент R4. Параметры R1–R4 соотносятся с формой клетки следующим образом:

153

где c это диаметр кольца, соответствующего максимальной толщине. Геометрический смысл параметров b, c, D и h показан на рис. 42.

Для того чтобы проверить может ли формула (179) описывать экспериментально измеренные формы, мы использовали в качестве эталона формулу (173) с параметрами Фанга и др. [209] (см. подраздел 3.1.1) и, считая D равным 7.65 мкм, варьировали b, c и h для минимизации СК разницы между новой и эталонной формой. В результате мы получили: b = 1.34 мкм, c = 4.74 мкм и h = 2.71 мкм [это значения для формы (179)]. Обе формы показаны на рис. 42 и хорошо согласуются, хотя полученные значения b и h немного меньше чем экспериментальные, приведённые в таблице 12. Та же процедура для формы (173) с другим набором параметров (Эванса и Фанга [208]) приводит к b = 0.71 мкм, c = 5.63 мкм, D = 7.82 мкм и h = 2.46 мкм (сравните с таблицей 12).

Важно заметить, что дополнительный параметр c, введённый формулой (179), тяжело точно измерить, так как он основан на положении плоского максимума профиля z(ρ). По этой же причине точность его определения вышеописанной подгонкой также относительно плохая, т.е. его изменение в небольшом интервале вокруг указанного значения можно практически полностью компенсировать изменением b и h. Следовательно можно рассматривать c как «внутреннюю» степень свободы, не связанную напрямую с параметрами, определяемыми микроскопом, но влияющую на производные параметры, такие как V и S.

154

3.3.2. Методология моделирования

Задача светорассеяния эритроцитом в потоке СПЦ полностью описывается шестью параметрами: b, c, D, h, HbC и β. Мы вычисляли индикатрисы эритроцитов, варьируя все эти параметры. Параметры из таблицы 12 (D, h, b и HbC) случайно

объединении доверительных интервалов разных исследователей за следующим исключением. Значение ИС, приведённое в [209], существенно выше чем в других, даже более современных исследованиях (см. таблицу 12), а другой важный аргумент в пользу выбора меньших значений ИС проистекает из результатов осмотического теста на резистентность. Этот тест применяется с 19-го века и с того времени накоплено много согласованных данных [237]. Более того использование современной модели статистического разрыва мембраны [238] вместо принципа «критического растяжения» упрощает анализ данных [216,218] и позволяет оценить распределение ИС в пробе. Для того чтобы уменьшить среднее значение ИС относительно результатов из [209], мы

Выбор конкретных коэффициентов в этих неравенствах довольно «эстетичен», но легко проверить, что они исключают формы, которые далеки от реальности. Как обсуждается в подразделе 3.3.1, не существует строгих обоснований в выборе интервала для c. Мы выбираем отношение c/D случайно из равномерного распределения на интервале [0.56,0.76], который исключает только явно нереалистичные значения. Последнее условие определяется требованием к производным величинам: V, S и ИС, лежать в физиологических диапазонах (см. таблицу 12):

Остаётся угол ориентации β (см. рис. 34), для которого мы показали в подразделе

3.2.4, что наиболее вероятное значение β = 90°. Для того чтобы детально рассмотреть этот феномен, мы вычислили индикатрисы для 2000 эритроцитов с β [60°,90°]. Используя алгоритм, описанный в подразделе 3.3.3, и экспериментальные данные нативных эритроцитов, мы показали, что β очень редко бывает меньше 75° (данные не приведены). Поэтому при дальнейшем моделировании β выбирался случайно из равномерного распределения на узком интервале от 75° до 90°.

155

Рис. 43. Несколько случайно выбранных профилей эритроцитов, используемых в МДД моделировании.

С помощью МДД мы вычислили 40 000 индикатрис эритроцитов с различными параметрами. При этом каждый параметр выбирался случайно из равномерных распределений на вышеописанных интервалах, отбрасывая те наборы параметров, что не удовлетворяли неравенствам (181) и (182). Несколько случайно выбранных профилей моделированных эритроцитов показаны на рис. 43. Мы использовали случайный выбор параметров вместо регулярного, поскольку он намного более гибкий и проще для реализации. Однако регулярная решётка в пространстве параметров имеет преимущества в некоторых случаях, например, при интерполяции между узлами решётки. Использовалась ADDA 0.75 (см. подраздел 2.4.2) с dpl = 10, длина волны была равна λ = 0.66 мкм, что соответствует 0.4936 мкм в среде. Для типичного эритроцита (см. подраздел 3.3.1) моделирование занимает около 4 мин на 4 узлах кластера LISA (см. параграф 2.4.3.1).

Для того чтобы оценить точность МДД, мы выбрали типичный эритроцит и получили очень точное решение с помощью методики экстраполяции (см. раздел 2.3),

используя дискретизацию вплоть до dpl = 51. Далее мы сравнили результаты для обычной дискретизации dpl = 10 с экстраполяцией – максимальное относительное отличие индикатрис в используемом диапазоне углов составляет 7%, а значение χ2 –

2×10−5 (см. подраздел 3.3.3), что намного меньше минимального значения χ2 для экспериментальных индикатрис (2×10−3, см. подраздел 3.3.4). Следовательно точность нашего МДД моделирования более чем достаточна для данных приложений.

3.3.3. Экспериментальный метод и процедура обращения

Процедура измерения 3000 индикатрис эритроцитов такая же, как описана в подразделе 3.2.2, за исключением использования лазера с немного другой длины волны

(λ = 0.66 мкм). Для характеризации используется χ2 метод со следующими изменениями. Вместо умножения на весовую функцию мы применяем к индикатрисе логарифмическое преобразование:

156

Таблица 14. Средние модули ошибок определения морфологических параметров эритроцита при использовании баз данных разного размера (получены усреднением по 500 теоретическим индикатрисам).

Кроме того используется немного другой диапазон θ: θ1 = 12° и θn = 55°. Начальный угол больше чем был раньше, поскольку для малых θ индикатриса чувствительна к отклонению положения частицы от центра капилляра в СПЦ, и теперь эта нестабильность не убирается за счёт весовой функции. Большее значение θn соответствует большему отношению сигнала к шуму для СПЦ, использованного в этом разделе, по сравнению с разделом 3.2 (однако нет никаких принципиальных отличий между двумя СПЦ). При большой интенсивности ( I >>1) формула (183) измеряет относительную разницу между индикатрисами, в то время как при I ≤ 1 – абсолютную. Коэффициент 1 примерно соответствует уровню шуму в описываемых экспериментах – когда величина I сравнима с шумом, что происходит при θ вблизи θn, абсолютные ошибки более оправданы чем относительные. Таким образом, формула (183) измеряет среднюю относительную разницу между двумя функциями, за исключением небольшого интервала углов вблизи θn.

Сначала мы опробовали χ2 метод на теоретических индикатрисах. Для этого мы случайно выбрали 500 индикатрис и определили их параметры с помощью χ2 метода варьируя размер базы данных (Nsim) от 500 до 40 000 индикатрис. Естественно, сами пробные индикатрисы не входили в эти базы данных, поэтому каждой из них ставятся в соответствие параметры другой, хотя и близкой, индикатрисы, что приводит к ненулевым χ2. Ошибка определения любого параметра есть просто разница реального и полученного значения, средние по всем пробным индикатрисам модули ошибок

(СМО) показаны в таблице 14 (β не включён, так он является свойством СПЦ, а не эритроцита). Важно отметить, что распределение этих ошибок широки – СО сравнимы со средними значениями.

Видно, что ошибки уменьшаются очень медленно с увеличением Nsim. СМО примерно равен средней разнице значений соответствующего параметра для соседних точек в шестимерном пространстве параметров. Если бы все параметры выбирались

157