ogurtsov_a_n_vvedenie_v_biofiziku_fizicheskie_osnovy_biotekh

Наилучшие результаты получаются, когда дополнительно учитывается структурная информация, полученная методами рентгеновской кристаллографии и ЯМР. Именно такой комбинированный подход позволил достичь современного понимания структуры и функций таких сложных комплексов биомолекул, как рибосома, большие вирусы, актин-миозиновые комплексы в саркомерах мускулатуры.

определяет относительную проницаемость различных участков образца.

Для определения структуры природных биомолекулярных структур используются данные как просвечивающей (или трансмиссионной)

электронной микроскопии( transmission electron microscopy, TEM), так и сканирующей электронной микроскопии( scanning electron microscopy, SEM).

Просвечивающая электронная микроскопия. Принцип просвечи-

вающей электронной микроскопии аналогичен обычной оптической микроскопии–пучок электронов облучает тонкий образец, и микроскоп

300

Рисунок 110 – Схемапросвечивающего электронного микроскопа

Электроны, вылетающие из электронной пушки, проходят через конденсорные линзы, которые фокусируют электроны на объекте. Пучок электронов проходит через образец. Линзы объектива и линзы проектора увеличивают прошедший луч и проецируют его на люминесцентный экран. Попадание высокоэнергетичных электронов возбуждает молекулы люминофора в экране, в результате чего создается видимое увеличенное изображение образца. Изображение регистрируется различными детекторами, такими, например, как камера прибора с зарядовой связью

(charge coupled device, CCD).

Изображения, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии с биологических образцов, как правило, обладают очень низкой контрастностью (поскольку массы биогенных элементов не слишком разнятся), поэтому их обычно окрашивают солями тяжелых металлов, таких, как уран или осмий. К сожалению, такое окрашивание

301

может привести к появлению артефактов в ходе обработки и сушки образцов.

Криоэлектронная микроскопия снижает риск получения таких артефактов, но снижается и контрастность изображений. Поскольку образцы вмораживают в лед, то контраст между биомолекулой и окружающим льдом получается очень низкий.

Зачастую, структуру объекта восстанавливают на основании суммирования и усреднения данных большого числа экспериментов. В некоторых случаях удается обработать дифференциальную информацию, полученную при сравнении изображений образца, которые поворачивают на небольшие углы. Такая электронная томография позволяет создать трехмерную модель объекта.

Для получения изображений поверхностей больших молекулярных ассоциатов зачастую используют сканирующую электронную микроскопию (рисунок 111).

Сканирующая электронная микроскопия воссоздает трехмерные изображения, регистрируя электроны, которые рассеиваются или испускаются поверхностью образца. Исследуемый объект фиксируют на подложке, высушивают и покрывают тонким слоем металла. И уже эту

302

металлическую поверхность сканируют узким пучком электронов, восстанавливая изображение. Получающиеся таким образом изображения очень наглядные, они дают хорошее представление о трехмерной структуре образца. Однако, поскольку необходимо напыление металлического слоя, разрешение такой методики гораздо ниже просвечивающего электронного микроскопа – порядка 10нм . Этого вполне достаточно для получения изображений больших молекулярных ассоциатов,таких,как полисомы (рисунок 111).

8.7. АТОМНО-СИЛОВАЯМИКРОСКОПИЯ

Атомно-силовая микроскопия, АСМ (atomic force microscopy, AFM) появилась только в восьмидесятых годах ХХ века. Она имитирует скорее осязание, чем зрение. Острый шип зонда, закрепленный на конце тонкого монокристаллического рычага (кантилевера), сканирует поверхность образца, подобно тому, как игла звукоснимателя проигрывателя воспроизводит структуру дорожки грампластинки (рисунок 112).

Рисунок 112 – Схемаатомно -силовогомикроскопа (АСМ)

303

Рисунок 114 – Дварежима сканирования: а–контактный ,б –динамический

(2) Для того чтобы избежать таких искажений используют другой вид сканирования, динамический режим( рисунок 114(б)) или "режим постукивания" (tapping mode). Кантилевер осциллирует так, что конец шипа только касается поверхности в ходе сканирования. Поскольку такие контакты очень короткие, то проблемы связанные со сдвиговыми силами,минимизируются.

Разрешение метода атомно-силовой микроскопии зависит от остроты шипа и составляет обычно 5–10нм .

Технология АСМ была успешно использована для картирования электростатического потенциала молекулы трансмембранного канала – порина OmpF. Атомно-силовая микроскопия выявила слияние пор в апикальной цитоплазматической мембране живых панкреатических клеток. С помощью метода АСМ показано, что сердечные и скелетные мышцы проявляют различную вязкость и эластичность. Атомно-силовая микроскопия позволяет визуализировать структуру биомолекул при физиологических условиях и получать топографические изображения при нанометровом разрешении. Примером может служить изучение сложного нативного комплекса шаперона из Sulfolobus solfataricus. Атомно-силовая микроскопия является также превосходной техникой для изучения начальных событий при взаимной адгезии клеток. На атомно-силовых изображениях мономолекулярных пленок белка –бычьего сывороточного

306

альбумина (БСА), адсорбированного на поверхности раздела масло-вода, можно различить отдельные мономеры и димеры (рисунок 115).

Атомно-силовая микроскопия стала действительно мощным методом исследования биообъектов, когда в нем стали использовать

образцы, погруженные в водную среду. Дело в том, что даже высушенные биообъекты на подложке все равно имеют тонкий слой воды, толщиной в несколько молекул, на поверхности. Капиллярные силы, которые возникают при погружении шипа кантилевера в этот слой воды, соизмеримы с силами взаимодействия самого шипа с исследуемыми биообъектами, что "маскирует" исследуемые эффекты и резко снижает чувствительность метода. Динамический режим "постукивания" несколько улучшает ситуацию, но при этом требуется создавать большую амплитуду осцилляций, чтобы шип каждый раз отрывался от слоя воды, преодолевая капиллярные силы. Решением всех этих проблем стало просто погружение и образца и кантилевера в водный раствор. Капиллярные силы исчезли, и взаимодействие шипа с образцом отображает только форму молекулы.

Атомно-силовая микроскопия прекрасно проявила себя при визуализации молекулярных биообъектов. Многочисленные системы, начиная от отдельных цепей ДНК до целых хромосом, были исследованы на атомном уровне. Преимуществом этого метода, по сравнению с вышеизложенными методами, является то, что объекты исследуются в

307

условиях, подобных условиям в живой клетке, и они имеют конформации,

соответствующие их природному функционированию.

Атомно-силовые микроскопы оказались также очень удобными для манипулирования отдельными биомолекулами: механическим касанием молекулу белка можно было адсорбировать на острие зонда, приподнять и перенести на другое место (рисунок 116).

Рисунок 116 – Манипуляции с молекулой белка с помощью атомносилового микроскопа

Метод АСМ также был особенно полезен в приложениях, где не требовалось создавать изображение поверхности. В этом случае микроскоп использовался для измерения сил притяжения между молекулами или сил, возникающих при растягивании( разворачивании) глобул биомолекул. При "насильственном" расплетании глобулы атомносиловой микроскоп обеспечивает чувствительный, в диапазоне пиконьютонов, метод измерения сил вдоль "координаты расплетания" (или траектории разворачивания) или разъединения (trajectory of stretching or separation) биомакромолекул, а это дает информацию, необходимую для понимания процессов белкового фолдинга, конформационной динамики ДНК и специфичности ферментов.

308

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Из каких компонентов состоит энергия изолированной молекулы?

2.Как по вращательным спектрам можно определить моменты инерции молекул?

3.Как учет ангармонизма влияет на вид колебательного спектра молекулы?

4.Какие ветви присутствуют в колебательно-вращательных спектрах молекул?

5.Какова причина появления антистоксовых линий в спектрах комбинационного рассеяния света?

6.Какие существуют виды нормальных колебаний?

7.Какие частоты называют характеристическими?

8.Каковы основные спектральные характеристики широких бесструктурных полос?

9.В чем достоинства и недостатки метода рентгеновской кристаллографии?

10.Для каких веществ невозможно использовать метод электронного парамагнитного резонанса?

11.В чем достоинства и недостатки метода ядерного магнитного резонанса?

12.В чем заключается эффект Мёссбауэра?

13.Какие виды электронной микроскопии вы знаете?

14.Опишите схему просвечивающего электронного микроскопа.

15.Опишите схему атомно-силового микроскопа.

16.Что такое кантилевер, и каким образом с кантилевера считывается информация о структуре поверхности образца?

17.Какие режимы сканирования образца используются в атомносиловой микроскопии?

18.Как атомно-силовые микроскопы можно использовать для манипулирования биомакромолекулами?

309

ТИПОВЫЕ ЗАДАЧИ

Задача 1. Найдите силу, действующую при центрифугировании на

сделает ротор до полной остановки, считая движение равнозамедленным. Задача 3. Определите угловую скорость вращения ротора центрифуги, в которой под действием силы F = 50 нН осаждаются лизосомы. Плотность лизосом ρ =1250 кг/м3, радиус лизосомы r = 0,8 мкм, радиус

ротора центрифуги R = 0,05 м.

Задача 4. В кислородной подушке m =10 г газа находится под некоторым давлением. Определите работу, которая совершается газом при изменении его объема от V1 = 2 л до V2 = 6 л,если процесс происходит при постоянной температуре t = 25°С.

Задача 5. Найдите среднюю величину смещения молекулы формамида в воде и в растворе сахарозы за время t =1 мин, если коэффициент диффузии этого вещества в воде и в сахарозе равны

разделяет камеру на две части. Плотность потока метиленового синего через мембрану постоянна и равна j = 3 10−4 М·см/с, причем концентрация его с одной стороны этой мембраны равна c1 =10−2 М, а с другой c2 = 2 10−3 М. Чему равен коэффициент диффузии этого вещества через мембрану?

310

Задача 7. Определите коэффициент диффузии в воде эритола, если среднее смещение его молекулы составляет l = 40 мкм.

Задача 8. Между внутренней частью клетки и наружным раствором существует разность потенциалов (мембранный потенциал

мембране и сравнить её с напряженностью электрического поля плоского

может составлять 1:3. Средняя площадь поверхности эритроцита равна Se =140 мкм2. Предполагая, что одна молекула холестерина занимает

m =8,5 мкг образует на поверхности воды монослойную пленку круглой формы диаметром d = 6,7 см. Вычислите площадь S , которую занимает одна молекула стеариновой кислоты.

Задача 12. Найдите расстояние между подуровнями энергии атома, помещенного в магнитное поле с индукцией B0,5= Тл, фактор g 2= . Какой частоте и длине волны электромагнитного излучения соответствует переход с одного подуровня на другой?

Задача 13. В радиоспектрометре электронного парамагнитного резонанса поглощаемая высокочастотная электромагнитная энергия соответствует длине волны λ = 3 см. При какой индукции постоянного магнитного поля будет наблюдаться электронный парамагнитный резонанс? Принять g = 2 .

311

Задача 14. Кислородная подушка вместимостью V =10 л содержит газ под давлением p =1013,25 кПа. Какое количество теплоты Q необходимо сообщить,чтобы нагреть кислород от t1 = 0°С до t2 = 37°С?

Задача 15. Вычислите изменение свободной энергии Гиббса G в реакции сгорания этилового спирта при температуре t = 25°С, если в этих

Задача 16. При переносе5 нмоль ионов калия из мышечного волокна лягушки в межклеточную среду работа, затраченная на преодоление сил электрического отталкивания,составила A = 41,24 мкДж. Вычислите разность потенциалов ϕ на цитоплазматической мембране.

Задача 17. Диполь, образованный зарядами q = 40 нКл с плечом l = 2 мм, свободно установился в электрическом поле напряженностью E = 5 кВ/м. Какую работу A необходимо совершить, чтобы развернуть диполь на угол 30°?

Задача 18. Принимая, что электрон в невозбужденном атоме водорода движется по круговой орбите радиусом r = 52,8 пм, определить магнитный момент pm эквивалентного кругового тока и орбитальный механический момент Le электрона. Из полученных данных определить гиромагнитное отношение орбитальных моментов.

Задача 19. Вычислить период T вращения электрона по круговой траектории в однородном магнитном поле напряженностью H = 20 кА/м.

Задача 20. Вычислить изменение электрохимического потенциала Δμ при переносе ионов натрия в клетку из внеклеточной среды, если известно, что концентрация этих ионов снаружи в 10раз больше, чем внутри клетки, а мембранный потенциал равен ϕM = −70 мВ. Температура t = 37°С.

Задача 21. Изменение свободной энергии в процессе переноса двух электронов от восстановленного никотинамидадениндинуклеотида на кислород составляет G0 = −220 кДж/ моль. Этот процесс сопряжен с

312

Задача 24. Вычислите энергию диполь-дипольного взаимодействия молекул этилового спирта, находящихся в водном растворе (ε =80 ) на

растворителя в воду при температуре t = 25°С энтальпия понижается на

ваальсового взаимодействия атомов углерода и азота. Эмпирические

движения электрона на третьей боровской орбите атома водорода. 313

Задача 30. Образование сахарозы из глюкозы и фруктозы идет с участием АТФ: глюкоза +фруктоза + АТФ R сахароза +АДФ + Pi. При t = 25°С изменение свободной энергии составляет G = −6,285 кДж/моль. Найти константу равновесия этой реакции и оценить, будет ли эта реакция самопроизвольной.

приложить для того, чтобы разорвать белковую цепь, если ковалентные связи в полипептидной цепи хорошо описываются потенциалом ЛенардаДжонса с параметрами ε и σ для углеродуглеродной связи 0,56·10–18 Дж и 0,152·10–9 м, а для углеродазотной связи 0,51·10–18 Дж и 0,149·10–9 м, соответственно.

Задача 35. Энергия водородной связи равна E = 0,03 10−18 Дж. Определить максимальную длину волны электромагнитной волны, которая достаточна для разрыва водородной связи.

максимальную длину волны электромагнитного излучения, которое способно ионизовать атом водорода.

Задача 37. На какое расстояние сместится зонд кантилевера атомносилового микроскопа, если коэффициент жесткость кантилевера k =10−3 Н/м, а параметры потенциала Ленарда-Джонса взаимодействия между образцом и зондом ε = 0,2 10−18 Дж и Re = 0,15 нм.

314

СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ОСНОВНАЯ

1.Біофізика / За ред. П.Г. Костюка. – К.: Обереги, 2001. – 544 с.

2.Биофизика / Под ред. проф. В.Ф. Антонова. – М.: Гуманит. изд. центр

ВЛАДОС, 1999. – 288 с.

3.Волькенштейн М.В. Биофизика. –М .: Наука, 1988. – 592с .

4.Рубин А.Б.Биофизика. – М.: Высш. шк., 1999.– Т.1, 440 с.–Т .2, 464с.

5.Рубин А.Б., Пытьева Н.Ф., Ризниченко Г.Ю. Кинетика биологических

процессов. –М .:Изд -во МГУ, 1987. – 304 с.

6.Тиманюк В.А., Животова Е.Н. Биофизика. –К .: Профессионал, 2004. – 704 с.

7.Владимиров Ю.А., Рощупкин Д. И., Потапенко А.Я., Деев А.И. Биофизика. – М.: Медицина, 1983. – 272 с.

8.Ремизов А.Н., Максина А.Г., Потапенко А.Я. Медицинская и биологическая физика. – М.: Дрофа, 2005. – 558 с.

9.Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. –М .: Мир, 2002. – 589 с.

10.Эткинс П. Физическая химия. – М.: Мир, 1980. – Т.1, 580 с. – Т.2, 584 с. 11.Lodish H., Berk A., Zipursky L.S., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J.

Molecular Cell Biology. – W.H.Freeman and Company, 2003. – 572 p.

12.Соросовский образовательный журнал. – Интернет-ресурс. – http://journal.issep.rssi.ru/

13.Protein Data Bank. – Интернет-ресурс. – http://www.pdb.org/

14.Goodsell D.S. Bionanothechnology: Lessons from nature. – New Jersey: Wiley-Liss Inc., 2004. – 337 p.

15.Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем. –М .: Техно-

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ

16.Pattabhi V., Gautham N. Biophysics. – New York: Kluwer Academic Publishers, 2002. – 253 p.

17.Cotterill R. Biophysics. – New York: Wiley, 2002. – 395 p. 18.Glazer G. Biophysics. – Berlin: Springer, 2001. – 361 p.

19.Kato M. Electromagnetics in Biology. – Tokyo: Springer, 2006. – 324 p. 20.Ревин В.В., Максимов Г.В., Кольс О.Р. Биофизика. – Саранск: Изд-во

Мордов.ун-та, 2002. – 156 с.

21.Губанов Н.И., Утепбергенов А.А. Медицинская биофизика. – М.:

Медицина, 1978. – 336 с.

22.Артюхов В.Г., Шмелева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика. –Воронеж: Изд-во Воронежск.ун-та, 1994. – 336 с.

23.Маршелл Э.Биофизическая химия. – М.: Мир, 1981. – 808 с. 24.Физическая химия / Под ред. К.С. Краснова. – М.: Высш. шк., 2001 –

Т.1, 512 с. –Т .2, 319 с.

25.Arrondo J.L.R., Alonso A. Advanced Techniques in Biophysics. – Berlin: Springer-Verlag, 2006. – 280 p.

26.Campbell G.C., Norman J.M. An Introduction to Environmental Biophysics.

– New York: Springer, 1998. – 286 p.

27.Damjanovich S. Biophysical Aspects of Transmembrane Signaling. – Berlin: Springer-Verlag, 2005. – 321 p.

28.Becker O.M., MacKerell A.D., Roux B., Watanabe M. Computational Biochemistry and Biophysics. – New York: M. Dekker, Inc., 2001. – 512 p.

29.Sneppen K., Giovanni Z. Physics in Molecular Biology. – Cambridge University Press, 2005. – 311 p.

30.Schulten K., Kosztin I. Lectures in Theoretical Biophysics. – Urbana: University of Illinois, 2000. – 206 p.

31.Finkelstein A.V., Ptitsyn O.B. Protein Physics. – London: Academic Press, 2002. – 354 p.

316

35.Огурцов А.Н. Молекулярная биология клетки. Основы клеточной организации. –Харьков : НТУ "ХПИ", 2006. – 169 с.

36.Огурцов А.Н. Молекулярная биология клетки.Основные молекулярные генетические механизмы. – Харьков: НТУ "ХПИ", 2007. – 120 с.

37.Огурцов А.Н. Молекулярная биология клетки. Молекулярные основы

41.Огурцов А.Н. Лекции по физике. Лекции по физической химии/

Интернет ресурс. – http://users.kpi.kharkov.ua/ogurtsov/pubindex.html 42.Kaandorp J.A. Fractal modelling: growth and form in biology. – Berlin:

Springer, 1994. – 223 p.

43.Perthame B. Transport Equations in Biology. – Basel: Birkhauser Verlag, 2007. – 198 p.

44.Nölting B. Methods in Modern Biophysics. – Berlin: Springer-Verlag, 2005.

– 257 p.

45.Уильямс В., Уильямс Х. Физическая химия для биологов. –М .: Мир, 1976. – 600 с.

46.Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. –

М.: ФАИР-Пресс, 1999. – 720 с.

47.Баблоянц А. Молекулы, динамика и жизнь. Введение в самоорганизацию материи. –М .:Мир , 1990. – 375 с.

48.Исаева В.В. Синергетика для биологов. –М .: Наука, 2005. – 158 с. 317

СОДЕРЖАНИЕ