ogurtsov_a_n_vvedenie_v_biofiziku_fizicheskie_osnovy_biotekh

структуру. Существует множество методик (в том числе и коммерчески реализуемых на рынке) такого изменения существующих генов. Сайтспецифические (точечные) мутации вносятся в ген с помощью специальных олигонуклеотидов (рисунок 87).

Рисунок 87 – Схемасайт -специфическогомутагенеза

Олигонуклеотид соответствует гену везде, кроме того сайта, в котором произведено изменение (обозначен черным цветом на рисунке). Это изменение может соответствовать только замене одной аминокислоты на другую, или представлять собой небольшую вставку или, наоборот, удаление короткого участка гена. При необходимых условиях этот олигонуклеотид гибридизируется с нитью ДНК, несмотря на несоответствие в данном сайте. Затем ДНК-полимераза достраивает остальную часть второй нити двойной спирали ДНК, используя олигонуклеотид в качестве праймера. После этого такая отредактированная нить ДНК отделяется, и по ней как по матрице синтезируется уже мутантная ДНК, содержащая те изменения, которые были сделаны в олигонуклеотиде. Затем используются процедуры клонирования и экспрессии для синтеза модифицированного белка.

Направленный (точечный) мутагенез революционизировал молеку-

лярную биологию. Это мощный метод определения функций отдельно взятой аминокислоты или участка белковой цепи. Например, отдельные аминокислоты могут быть подвергнуты заменам по очереди, определяя при этом какие из них влияют на функционирование белка. Таким способом могут быть локализованы те аминокислоты, которые формируют активный центр фермента или центр связывания гормона.

Направленный точечный мутагенез также широко используется для того, чтобы увеличить стабильность белков, конструируя дополнительные перекрестные связи в глобуле или улучшая укладку аминокислотных остатков внутри глобулы. Например, одна из попыток увеличения стабильности белка лизозима изображена на рисунке 88.

Лизозим (или лизоцим, мурамидаза) – фермент класса гидролаз, который катализирует гидролиз β(1–4)гл- икозидных связей между остатками аминосахаров N-ацетилглюкозамина и N- ацетилмурамовой кислоты в полисахаридных цепях муреинов (гетерополисахаридов стенок бактериальных клеток), что ведет к разрушению оболочки бактериальной клетки.

аб

Лизозим обнаружен у фагов, бактерий, растений, животных (в слюне, слезах, на слизистой оболочке носа и т. д.). В больших количествах лизоцим содержится в белке куриного яйца. В организме лизозим выполняет функцию неспецифического антибактериального барьера. Наиболее хорошо изучен лизозим яичного белка, состоящий из одной полипептидной цепи (129аминокислот ) с молекулярной массой около 14 000Да . Лизозим – это первый фермент, для которого методом рентгеноструктурного анализа установлена третичная структура и выявлена связь между пространственным строением фермента и механизмом его действия. (Препарат лизоцим применяют в медицине).

В природном лизозиме аминокислоты концов цепи находятся рядом (рисунок 88(а )). Замена этих аминокислот на цистеины позволяет образовать дисульфидный мостик между ними (показан черным цветом на рисунке 88(б )), который делает структуру лизозима более устойчивой.

Однако в этом направлении достигнуты лишь скромные успехи. При этом оказалось, что это является очень сложной задачей –предугадать , какие модификации белковой цепи не угрожают разрушить стабильность структуры и функциональность природных белков.

Технология слияния белков. Технология рекомбинантных ДНК используется также для соединения целых генов, формируя объединенный белок, который сочетает функции обоих компонентов. При этом, разрабатывая место " стыковки" доменов, надо следить, чтобы соединяемые белки не заблокировали друг друга в процессе фолдинга. К счастью, большинство естественных белков достаточно прочны и сохраняют свою функциональность даже при объединении в большие структуры. Применяя технологию слияния белков можно использовать для своих нужд клеточные механизмы транспорта белков. В клетках белки, которые должны быть перенесены к разным клеточным компартментам, отмечаются специальными сигнальными пептидами на концах белковых цепей. Эти пептиды распознаются транспортными системами клетки, и после доставки в нужный компартмент,удаляются .

Используя технику рекомбинантных ДНК можно добавить сигнальный пептид к данному белку, направляя его тем самым в

специфическую область клетки. Например, можно добавить сигнальный

262

пептид, адресующий белок в секреторные везикулы. Такой белок будет выводиться из клетки во внеклеточную среду, где его уже достаточно легко собрать и очистить.

Перспективным также является конструирование химерных белков

(рисунок 89).

иммунотоксины были созданы комбинируя антитела (иммуноглобулины), которые связываются с раковыми клетками, с белками-токсинами, которые убивают эти клетки (рисунок 89).Иммунотоксин находит раковую клетку и убивает ее, снижая побочные эффекты традиционной антираковой хемотерапии. Для визуализации клеточных процессов зеленый флуоресцентный протеин (green fluorescent protein, GFP) из медуз

которых синтезируются эти исследуемые белки, будут светиться зеленым светом.

Моноклональные антитела. Множество применений биотехнологии таких, как биосенсорика или обнаружение патологических изменений вызванных определенной болезнью, требуют эффективных методов распознавания индивидуальных молекул. Иммунная система животных была создана эволюцией именно для выполнения этой задачи, поэтому имеет смысл использовать наработанные природой решения для наших целей. Главным "инструментом" иммунной системы является антитело (иммуноглобулин) (рисунок 90). Молекула антитела имеет два связывающих домена (две "руки" антитела), имеющих специальные специфические центры связывания с антигенами. Эти связывающие домены соединены гибкими линкерами с центральным доменом антитела. Форма центра связывания (области связывания антигена) точно соответствует только данной молекуле антигена. На рисунке показаны два примера связывания антител. Справа рука антитела имеет большую плоскую область связывания, с которой связана молекула лизозима. Слева рука антитела имеет центр связывание в виде глубокого кармана, в котором связана молекула фуллерена.

Антитела, это белки, которые специфически связываются с молекулами, которые являются чуждыми для организма, такие как инфекционные патогены. Иммунная система человека способна синтезировать около 10 15 различных видов антител, каждый с индивидуальной специфичностью. Комбинируя эту природную библиотеку молекул с современными методами синтеза антител, сегодня стало возможным получать антитела, обладающие высокой специфичностью к любой мыслимой молекуле.

Антитела синтезируются В-клетками (В-лимфоциты, вид белых кровяных телец) и составляют около 20%белка в плазме крови человека. Каждая В-клетка синтезирует только единственный тип антител. На своей поверхности В-клетка имеет прочно связанные с её мембраной "сигнальные" антитела того типа, который она способна синтезировать. Связывание этих присоединенных антител данной В-клетки с

соответствующим антигеном стимулирует В-клетку к началу

264

размножения и активного синтеза антител, которые выводятся в плазму крови и обладают той же специфичностью, что и " сигнальные" антитела на поверхности В-клетки.

Рисунок 90 –Схема антитела( вверху) и примеры связывания с различными молекулами (внизу)

265

Впроцессе размножения В-клеток может происходить модификация центров связывания у антител. Те дочерние клетки, у антител которых центры связывания более эффективны, чаще и прочнее связываются с антигенами и, тем самым, имеют преимущество в дальнейшем росте и размножении. Те же дочерние клетки, центры связывания которых связываются с антигенами слабее, хуже размножаются. Так осуществляется отбор и "юстировка" иммунной системы под ксенобиотики.

Исключительная селективность антител используется во многих приложениях. Они являются превосходным индикатором, распознавая нужные объекты. Например, особые антитела используются для распознавания ВИЧ в крови и этом основаны тесты на ВИЧ, или же, другие антитела распознают определенные гормоны в моче, обеспечивая функционирование тестов на беременность. Антитела могут быть использованы для локализации местоположения определенного белка в организмах (в исследовательских или медицинских целях).

Если животное инфицируется данной чужеродной молекулой (антигеном), его клетки синтезируют множество различных антител, связывающихся с различными участками (антигенными детерминантами или эпитопами) этого антигена. В большинстве случаев использование такой однородной смеси разных антител не целесообразно, необходимо выделить лишь одно характеристическое антитело. Для этого надо выделить ту единственную В-клетку, которая синтезирует это антитело, и, затем, культивировать её. Однако число актов деления В-клеток ограничено, поэтому не удается синтезировать необходимое количество антител.

Вконце 70хгодов ХХ века эта проблема была решена. В-клетки были соединены с "бессмертными" раковыми клетками. Такие комбинированные клетки можно культивировать, синтезируя нужное количество антител. Такие антитела называются моноклональные антитела, поскольку они произведены клонированием идентичных комбинированных клеток. Сегодня моноклональные антитела могут быть синтезированы для практически любого мыслимого антигена.

266

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Почему подходы равновесной термодинамики не применимы для описания биосистем?

2.Что дает переход к локальным переменным при описании биосистем?

3.Как связаны обобщенные силы и обобщенные потоки в термодинамике линейных необратимых процессов?

4.Приведите примеры линейных необратимых процессов.

5.Почему на биомембранах не выполняется принцип КюриПригожиина?

6.Какое состояние называется состоянием проточного равновесия?

7.В чем принципиальное отличие биологических мембран от искусственных небиологических полу проницаемых мембран?

8.Какое количество информации необходимо иметь для того, чтобы осуществить единственно правильное расположение клеток в организме?

9.Какие основные ферментативные "инструменты" используют в технологии рекомбинантных ДНК?

10.Для чего используют термоциклирование в полимеразной цепной реакции?

11.Какой плазмидный вектор называют экспрессионным?

12.Почему прокариотические экспрессионные системы не всегда пригодны для биотехнологического синтеза белков?

13.В чем преимущества бесклеточного синтеза белков?

14.Для чего используют точечный мутагенез?

15.Какие белки называют химерными?

16.Приведите примеры использования иммуноглобулинов.

17.В чем отличие моноклональных антител от поликлональных?

267

Глава 8

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

8.1. МОЛЕКУЛЯРНАЯСПЕКТРОСКОПИЯ

Схема энергетических состояний изолированных молекул.

Спектроскопические методы используются при исследованиях структуры и энергетических уровней биомолекул. Экспериментально спектры получают при помощи трех основных методов:

1)спектроскопии испускания (эмиссионной спектроскопии),

2)спектроскопии поглощения (абсорбционной спектроскопии),

3)спектроскопии комбинационного рассеяния (раман-спектроскопии).

Если происходит переход из состояния с энергией E′′ в состояние с энергией E′, то в спектре наблюдается линия с частотой ν, которая определяется соотношением

hν = E′′− E′.

Это соотношение можно выразить через длину волны λ = νc или через волновое число k = λ1 = νc , (откуда следует соотношение ν = ck ).

Волновое число показывает, сколько длин волн умещается на 1 см; их измеряют в обратных сантиметрах (см–-1). 1 см–-1 = 100 м–1.

Переходы между этими величинами и их связь с различными областями электромагнитного спектра представлены на рисунке 91.

Любая биологическая молекула является квантовой системой; она описывается уравнением Шредингера, учитывающим движение электронов в молекуле, колебания атомов в молекуле, вращение молекулы. Решение этого уравнения даже для случая простейших молекул – очень сложная задача, которая (учитывая огромное различие в массах электронов и ядер) обычно разбивается на две: для электронов и ядер. Энергию изолированной молекулы можно представить в виде суммы

E ≈ Eэл + Екол + Евращ = hνэл + hνкол + hνвращ ,

где Eэл –энергия движения электронов относительно ядер (диапазон

268

энергий e на рисунке 91), Eкол –энергия колебаний( v ) атомных ядер, Eвращ – энергия вращения ( r ) ядер (диапазоны v и r на рисунке 91).

Рисунок 91 – Шкалаэлектромагнитныхволн

Eкол ≈10−2 ÷10−1 эВ (0,5–40 кДж/моль , 30–4000 см–1); Евращ ≈10−5 ÷10−3 эВ (10–1–1см –1).

Наиболее высоки кванты энергии, поглощаемые или испускаемые при электронных переходах (видимая и ультрафиолетовая (УФ) области

269

МВспектры). Поэтому электронный переход обычно сопровождается колебательными и вращательными переходами, т. е. представляет собой

электронно- колебательно-вращательный переход. Частота соответствую-

щей линии в спектре

ν = νэл + νкол + νвращ .

На рисунке 92(а) представлена схема двух электронных уровней A и B молекул, соответствующие им колебательные и вращательные уровни, стрелками показаны примеры колебательновращательных и электронноколебательновращательных переходов.

Рисунок 92 – Энергетические переходы: а –электронно- колебательно-враща- тельные,б –структура вращательногоспектра

Не все мыслимые переходы будут реализовываться в поглощении или испускании света. Квантовая механика однозначно формулирует правила отбора, которые определяют, будет ли переход разрешенным или запрещенным. В самом общем виде правила отбора следуют из следующих соображений.

Для вращательных переходов: испускать или поглощать излучение путем перехода между различными состояниями вращения могут только молекулы с постоянным дипольным моментом.

Для колебательных переходов: возбуждаться электромагнитным излучением или генерировать излучение могут только те колебания, которые сопровождаются изменением дипольного момента.

Вращательное состояние молекул. В классической механике произвольное вращение твердого тела в самом общем случае может быть представлено как комбинация трех вращательных движений относительно трех взаимно перпендикулярных главных осей вращения (обозначим эти оси x, y, z ) с угловыми частотами ωx ,ωy ,ωz .Энергия такого вращения

Вквантовой механике момент импульса (механический момент)

квантуется.

Взависимости от соотношения между главными моментами инерции молекулы подразделяются на

• сферические волчки (все главные моменты инерции равны Ixx = I yy = Izz = I ) такие,как метан, (рисунок 93),

•симметричные волчки ( Ixx = I yy ≠ Izz ) такие, как аммиак или хлористый метил,

•линейные молекулы такие, как CO2 и любые двухатомные молекулы.

Рисунок 93 – Типымолекулярных волчков

Энергия вращения классического сферического волчка

вращательная постоянная молекулы.

Вращение симметричного волчка квантуется более сложным образом, поскольку, кроме вращения относительно оси высокой симметрии z (I|| = Izz ) , необходимо квантовать еще и вращение

относительно осей x и y перпендикулярных оси высокой симметрии

В линейной молекуле K = 0 , поэтому положение энергетических уровней будет определяться соотношением

Eвр = BJ (J +1) ,

2

где B = 2I , а I – простой( механический) момент инерции( I = I ).

Правило отбора для вращательных спектров поглощения (переход J ′′ → J ′) и испускания (переход J ′ → J ′′):

J= J ′− J ′′ = ±1.

Вспектроскопии принято индексом «'»обозначать состояние с большей энергией (верхнее), а индексом «"» – нижнее состояние с меньшей энергией (нижнее).

При этом энергетический спектр разрешенных переходов определяется соотношением

Eвр = 2B(J +1) ,

а разность энергии между соседними линиями вращательного спектра равна

EJ − EJ −1 = 2B ,

что позволяет по вращательным спектрам определять моменты инерции молекул и, зная пространственную структуру молекул, определять

межъядерные расстояния в молекуле (рисунок 92(б)).

Напомним, что "активными" во "вращательном" поглощении и излучении будут только асимметричные молекулы, имеющие постоянный дипольный момент. Помещая молекулы во внешнее электрическое поле, и измеряя смещение вращательных спектральных линий в зависимости от величины приложенного поля, можно определить дипольные моменты молекул.

Колебательное состояние молекул. Классическое уравнение движения гармонического осциллятора, состоящего из двух материальных точек массой m , связанных невесомой пружиной с жесткостью k относительно равновесного положения re определяется возвращающей

силой Гука F = −kx ,где x = r − re и имеет вид mx = −kx .

273

Его решение имеет вид

x = x0 sin(2πνt + ϕ) ,

где частота колебаний определяется соотношением

положения равновесия.

Квантовомеханическое решение уравнения Шредингера приводит к квантованию энергии гармонического осциллятора

E0 = 12 hνкол ,

которые присущи квантовомеханическим системам даже при T =0К . Правило отбора: переходы с испусканием или поглощением

возможны только между соседними колебательными уровнями

υ =υ′−υ′′ = ±1.

Поэтому спектр излучения (или поглощения) гармонического осциллятора (рисунок 94(а)) имеет единственную линию с частотой ν ,

В двухатомной молекуле, в отличие от модели гармонического осциллятора, сближению атомов препятствует взаимодействие электронных оболочек, а при удалении атомов возвращающая сила становится не пропорциональной расстоянию.

274

а б

Рисунок 94 – Потенциальные кривые и спектры: а –гармонического осциллятора,б –молекулы

Потенциальная кривая для двухатомных молекул не является параболой( рисунок 94(б)), а хорошо описывается потенциалом Морзе

U (r) = De {1−exp(−β[r − re ])}2 ,

где β – константа для данной молекулы.

Движение атомов в колеблющейся молекуле не является гармоническим. Учет ангармонизма (в первом порядке) приводит к следующему выражению для квантования энергии

где xe – постоянная ангармоничности.

Колебательный спектр ангармонического осциллятора (рисунок 94(б)) представляет собой серию линий, расстояние между которыми уменьшается по мере роста υ и стремится к пределу, за которым начинается сплошной спектр. Коротковолновой границе полосатого

химической связи по колебательным спектрам.

275

Колебательно-вращательные спектры. В свободном состоянии молекулы вещества одновременно участвуют и в колебательном, и во вращательном движениях. Их колебательновращательные спектры имеют характерный вид,подобный спектру поглощения HCl (рисунок 95).

Рисунок 95 – Колебательновращательныйспектр молекулы HCl

Энергетические уровни молекулы определяются формулой

При этом правила отбора имеют вид:

υ = υ′− υ′′ = ±1,

J= J′− J′′ = ±1.

Висключительных случаях (как правило, для сложных молекул)

E= hνкол − 2BJ

иветвь формируется с "красной" стороны от чисто колебательного

перехода hνкол эквидистантными линиями при частотах

hνкол − 2B,hνкол − 4B,…

Q-ветвь формируется переходами с υ =1, J = 0

E= hνкол .

276

Рисунок 96 – ОбразованиеP-, Qи- R- ветвей

Поэтому, Q-ветвь, если она разрешена, представляет собой одну линию при частоте данного колебательного перехода. ДляHCl такой переход запрещен.

Переходы с υ =1 и J = +1 формируют R-ветвь.Для R-ветви

E= hνкол + 2B(J +1)

иветвь образуется эквидистантными линиями с "голубой" стороны от чисто колебательного перехода hνкол . Эти линии смещены на 2B , 4B,… в

сторону высоких частот. Расстояние между P - и R - ветвями колебательного перехода дает значение вращательной постоянной, и поэтому из колебательного спектра можно получить длину связи в

277

молекуле, и нет необходимости снимать чисто вращательный спектр (хотя последний дает более точные результаты).

Комбинационное рассеяние( КР) света. Если через прозрачное вещество в кювете пропускать параллельный пучок света, то некоторая его часть рассеивается во всех направлениях.

Допустим, что источник света–монохроматический– Тогда в спектре рассеяния будут наблюдаться

1)интенсивная (основная) линия с такой же частотой ν = ν′;

2)слабые линии ("спутники" основной линии рассеяния) с частотами меньше "основной"частоты ν < ν′ – стоксовы линии;

3)"спутники" с частотами большими "основной" частоты ν > ν′ –

антистоксовы линии.

Рассеяние без изменения частоты и, соответственно, энергии молекулы называют классическим, упругим или релеевским рассеянием (по имени физика Дж.У. Релея). При столкновении фотона с молекулой он может отдать часть собственной энергии, стимулируя вращение или колебание молекулы, и выйти с более низкой частотой –так формируются стоксовы линии. Фотон может забрать часть колебательной или вращательной энергии молекулы и выйти с более высокой частотой –так формируются антистоксовы линии.

Возникновение спутников основной частоты называется комбинационным, сверхупругим или рамановским рассеянием (по имени индийского физика Рамана).

Правила отбора для КР-процессов отличаются от нормальных процессов поглощения или излучения света. Причина отличия заключается в том, что в КР-процессах участвуют два фотона –один

поглощения или испускания, которые требуют наличия и изменения дипольного момента молекулы, в комбинационном рассеянии будут активны только те молекулы, которые обладают анизотропной

поляризуемости молекулы должна зависеть от направления в котором приложено внешнее поле.

В каком-то смысле КР-рассеяние света является методом, дополнительным к ИКпоглощеню, поскольку симметричные молекулы типа O2 , N2 ,Cl2 (не имеющие дипольного момента) не активные в ИКпоглощении легче всего поляризуются во внешнем поле и, следовательно, активны в КР-рассеянии.

Специфические правила отбора для спектров комбинационного рассеяния (рисунок 97).

279