ogurtsov_a_n_vvedenie_v_biofiziku_fizicheskie_osnovy_biotekh

Разность химических потенциалов μC связана с осмотическим давлением Δπ, которое компенсирует разницу в концентрациях растворов по обе стороны мембраны.Согласно закону Вант-Гофа

ΔμC = RT dccC ,

C

где cC – средняя концентрация сахарозы в системе

cC = 12 (cCA + cCB ).

Следовательно,

ΔμC = cCπ .

Связь двух сопряженных потоков, растворенного вещества и растворителя,подчиняется уравнению Гиббса–Дюгема

cC μC + cBΔμB = 0 .

J p = JC υC + JBυB ,

240

JD = JC − JBυB ,

cC

где J p – объемный поток, JD – диффузионный поток.Теперь

Tσ = J p p + JDΔπ.

Для сопряженных потоков J p и JD в соответствии с уравнениями

Ji = ∑Lij X j запишем

j

J p = Lpp p + LpDΔπ,

JD = LDp p + LDDΔπ.

Определим смысл феноменологических коэффициентов. Во-первых, рассмотрим ситуацию, когда концентрация сахарозы

одинакова по обе стороны мембраны cA = cB . При этом Δπ = 0 . Следовательно,

J p = Lpp p ,

JD = LDp p .

Таким образом, разница в гидростатическом давлении вызывает объемный поток J p и добавочный диффузионный поток JD , который приводит к

перераспределению сахарозы. Это явление называется ультрафильтра-

ция,а коэффициент LDp называется коэффициентом ультрафильтрации.

Во-вторых, рассмотрим случай, когда гидростатическое давление одинаково по обе стороны мембраны, т.е . p = 0 ,тогда

J p = LpDΔπ,

JD = LDDΔπ.

Коэффициент LDD называется коэффициентом проницаемости вещества через мембрану. Добавочный объемный поток J p называется

осмотическим потоком, а коэффициент LpD –коэффициентом осмотичес-

кого потока. Используя соотношение взаимности Онзагера Lij = Lji , получим связь между потоками

241

Теперь рассмотрим ситуацию,когда объемный поток J p = 0 .Тогда

Lpp p = −LpDΔπ.

Введем новую постоянную κ, которая называется коэффициентом отражения (константой Ставермана)

κ= LpD . Lpp

Коэффициент отражения κ зависит от свойств мембраны. Запишем объемный поток с учетом κ

J p = Lpp ( p − κΔπ) .

Рассмотрим две гипотетические крайние ситуации. Если κ =1, то растворенное вещество совсем не проникает через мембрану( полностью "отражается"от мембраны), тогда

J p = Lpp ( p − Δπ) .

Если κ = 0 ,то мембрана полностью проницаема и

происходит независимо от переноса растворенного вещества. В реальных ситуациях κ ≤1 и LpD ≠0 , что указывает на связь между потоками J p и

JD . Это существенное обстоятельство, которое часто игнорируется, когда (ошибочно) рассматривают процессы переноса воды и веществ в клетку независимо. Только применение положений линейной неравновесной термодинамики и использование соотношения взаимности Онзагера к явлениям переноса через клеточную мембрану позволяют количественно верно описывать транспорт веществ в клетку.

Следует также помнить, что биологические мембраны принципиально отличаются от искусственных небиологических полупроницаемых мембран( например, пористых резиновых перегородок,

242

разделяющих две жидкие фазы) существованием процессов облегченного и активного транспорта, которые можно описать, только используя методы неравновесной термодинамики.

Например, К+-Nа+-АТФаза обеспечивает одновременный перенос ионов натрия и калия через мембрану. Мы можем выделить "обменную" силу

X обм = μNa + − μK+ ,

которая описывает общий ионный обмен через мембрану. Суммарный обменный поток Jобм обозначает, что К+-ионы обмениваются на Nа+- ионы.

Остальные (r, rest) сопряженные силы X r обеспечивают химические потоки Jr .Тогда производство локальной энтропии внутри мембраны

σ= X обм J обм + X r J r

исоответственно в линейном приближении

J обм = L11 X обм + L12 X r

J r = L21 X обм + L22 X r

По определению в активном транспорте поток Jобм направлен против действия сил X обм . Это возможно только тогда, когда коэффициенты L12 = L21 не равны нулю.

Действительно, согласно условию Lii > 0 коэффициент L11 должен быть положительной величиной. Следовательно, если L12 = 0 , то из

Jобм = L11 X обм + L12 X r следует, что Jобм и X обм должны иметь одинаковый знак, и активный транспорт становится невозможным. Если же

значение. Без сопряжения потоков и сил различного рода процессы, приводящие к понижению значения энтропии,были бы невозможны.

243

Рассмотрим два процесса, которые протекают в везикулах,

трансформируется в энергию транспорта протонов JH X H .

Введем коэффициент трансформации η, который при условии

трансформируется в другой вид энергии на 100%), то можно показать, что максимальный коэффициент трансформации равен

значение η уменьшается. В то время как в закрытых системах коэффициент сопряжения между обычными реакциями выражается целыми числами, в открытых системах, например, в случае окислительного фосфорилирования в биомембранах, сопряжение между процессами потребления кислорода и фосфорилирования выражается

дробным числом.

Как уже говорилось выше, любая открытая система вообще (и биомембраны в частности) может находиться в стационарном, хотя и

неравновесном состоянии.

244

Это состояние характеризуется постоянным значением энтропии. Живой организм существует в этом состоянии при условии, что при изменении одних параметров другие сохраняют постоянное значение.

В нашем примере изменение энтропии к объему с учетом L12 = L21 будет равно

величины,пропорциональные X 20 .

Иными словами, в стационарном состоянии, близком к равновесию, изменение энтропии минимально. Это состояние подобно равновесному состоянию в закрытых системах, как уже отмечалось, за счет сопряжения различных потоков могут протекать процессы, характеризующиеся отрицательным изменением энтропии в других потоках. Это явление компенсации потока с отрицательной энтропией является одним из необходимых условий обеспечения жизнедеятельности организма.

Термодинамика систем вдали от равновесия. Определить возможность самопроизвольного перехода изолированной системы между двумя состояниями можно методами классической термодинамики, сравнивая значение энтропии этих состояний. В открытой системе возникают стационарные состояния, которые могут находиться далеко от термодинамического равновесия. Возможность перехода открытой системы из некоторого начального в конечное стационарное состояние, если оба состояния лежат вблизи термодинамического равновесия определяется теоремой Пригожина. Однако вдали от равновесия уже нельзя сделать однозначных выводов о том, как меняется скорость образования энтропии при приближении к стационарному состоянию. Эволюция таких неравновесных динамических систем определяется,

245

прежде всего, кинетикой взаимодействия составных элементов, а не статистической упорядоченностью начального и конечного состояния системы согласно классической термодинамике. Такие системы имеют ограниченное число конечных состояний и ведут себя наподобие химических машин. Поэтому распространение идей термодинамики на неравновесные системы может дать лишь дополнительную характеристику далеких от равновесия стационарных состояний, а положение и пути достижения этих самых стационарных состояний определяются кинетическими уравнениями.

По мере удаления от равновесия будут расти величины X и J и система может удалиться от равновесия и покинуть область линейной термодинамики, не теряя общей устойчивости. Возможно, однако, что при удалении от равновесия в системе наступает бифуркационное изменение и возникает неустойчивость. Возникает, как говорят, термодинамическая флуктуация, уводящая систему от неустойчивой точки, что может стать причиной распада системы. Однако при определенных значениях параметров эта флуктуация как бы дает толчок, переводящий систему к новому состоянию, которому и передается устойчивость. Например, появлению предельного цикла, возникновению диссипативных структур в распределенных системах также предшествует нарушение термодинамической устойчивости вдали от равновесия. Наконец, переходы между устойчивыми стационарными состояниями происходят на границе устойчивости, когда система совершает скачкообразный переход между ними.

Таким образом, термодинамические признаки устойчивости стационарных состояний совпадают с соответствующими математическими признаками и могут служить их дополнительной характеристикой. Однако вдали от равновесия не существует общих термодинамических критериев направления движения открытой системы, поскольку ее поведение определяется динамическими свойствами и механизмами регуляции, а не общими статистическими закономерностями, как во втором законе классической термодинамики. Эта особенность обусловливает также и сложность применения понятий

246

энтропии и информации при описании общих свойств биологических систем.

7.4. БИОЛОГИЧЕСКАЯИНФОРМАЦИЯ

Согласно формуле Больцмана, энтропия определяется как логарифм

где kB –постоянная Больцмана, W –число микросостояний( например, число способов, которыми можно разместить молекулы газа в сосуде). Именно в этом смысле энтропия есть мера неупорядоченности и хаотизации системы. В реальных системах существуют устойчивые и неустойчивые степени свободы. Им соответствуют, например, твердые стенки сосуда и молекулы заключенного в нем газа.

Понятие энтропии связано именно с неустойчивыми степенями, по которым возможна хаотизация системы, а число возможных микросостояний намного больше единицы. В полностью устойчивых системах реализуется только одно-единственное решение, то есть число способов, которыми осуществляется это единственное макросостояние системы, равно единице (W =1), а, следовательно, энтропия равна нулю. В биологии использовать понятие "энтропия", а, следовательно, и термодинамические представления можно только по отношению к конкретным метаболическим процессам, а не для описания в целом поведения и общебиологических свойств организмов. Связь энтропии и информации в теории информации была установлена для статистических степеней свободы. Допустим, что мы получили информацию о том, каким конкретно способом из всех возможных способов осуществлено данное макросостояние системы. Очевидно, количество информации, которое мы при этом получали, будет тем больше, чем больше была исходная неопределенность, или энтропия, системы. Согласно теории информации, в этом случае количество информации о единственном реальном состоянии системы

I= log2 W . 247

За единицу количества информации (бит) принимается информация, содержащаяся в достоверном сообщении, когда число исходных возможных состояний было равно W = 2

I = log2 W =1бит.

Например, сообщение о том, на какую сторону упала монета при бросании в воздух, содержит количество информации в 1 бит . Сопоставляя формулы S = kB lnW и I = log2 W можно найти связь между

энтропией в энтропийных единицах (1 э.е. = 4,1Дж/К ) и информацией в битах S (э.е.) = 2,3·10–24 I (бит).

Оценим теперь количество информации, содержащейся в теле человека. Тело человека содержит примерно 1013 клеток. Допустим, что среди них нет ни одной пары одинаковых и что ни одну пару нельзя поменять местами без нарушения функционирования организма. Это значит, что относительное расположение клеток в теле человека однозначно. Количество информации, необходимой для построения такой единственной структуры из 1013! возможных,

I = log2 (1013 !) ≈1013 log2 1013 ≈ 4 1014 бит.

Такое количество информации необходимо было бы исходно получить, чтобы осуществить единственно правильное расположение клеток в организме. Этому эквивалентно весьма незначительное снижение энтропии системы на

S = 2,3 10−24 4 1014 ≈10−9 э.е. ≈ 4 10−9 Дж/К .

Если считать, что в организме осуществляется также уникальный характер расположения аминокислотных остатков в белках и нуклеиновых остатков в ДНК, то общее количество информации, содержащейся в теле человека, составит I =1,3 1026 бит, что эквивалентно небольшому понижению энтропии на S ≈300 э.е. = 1200 Дж/К . В процессах метаболизма это снижение энтропии легко компенсируется увеличением энтропии при окислении 900молекул глюкозы. Таким образом, формально сопоставление формул S = kB lnW и I = log2 W показывает, что биологические системы не обладают какой-либо повышенной информационной емкостью по сравнению с другими неживыми

248

системами, состоящими из того же числа структурных элементов. Этот вывод на первый взгляд противоречит роли и значению информационных процессов в биологии.

Однако связь между I и S справедлива лишь по отношению к информации о том, какое из всех W микросостояний реализовано в данный момент. Эту микроинформацию, связанную с расположением всех атомов в системе, на самом деле нельзя запомнить и сохранить, поскольку любое из таких микросостояний быстро перейдет в другое из-за тепловых флуктуаций. А ценность биологической информации определяется не количеством, а прежде всего возможностью ее запоминания, хранения, переработки и дальнейшей передачи для использования в жизнедеятельности организма. Основное условие восприятия и запоминания информации – способность рецепторной системы переходить вследствие полученной информации в одно из устойчивых состояний, заранее заданных в силу ее организации. Поэтому информационные процессы в организованных системах связаны только с определенными степенями свободы. Сам процесс запоминания информации должен сопровождаться некоторой потерей энергии в рецепторной системе для того, чтобы она могла в ней сохраниться достаточное время и не теряться вследствие тепловых флуктуаций. Именно здесь и осуществляется превращение микроинформации, которую система не могла запомнить, в макроинформацию, которую система запоминает, хранит и затем может передать другим акцепторным системам. Как говорят, энтропия есть мера множества незапоминаемых системой микросостояний, а макроинформация –мер а множества их состояний, о пребывании в которых система должна помнить.

Информационная емкость в ДНК, например, определяется не только количеством определенных нуклеотидов, а общим числом микросостояний, включающих колебания всех атомов цепочки ДНК. Процесс запоминания информации в ДНК – это фиксация определенного расположения нуклеотидов, которое устойчиво вследствие образующихся химических связей в цепочке. Дальнейшая передача генетической информации осуществляется в результате биохимических процессов, в

которых диссипация энергии и образование соответствующих химических

249

устойчивых структур обеспечивают эффективность биологической переработки информации.

В целом информационные процессы широко распространены в биологии. На молекулярном уровне они протекают не только при запоминании и переработке генетической информации, но и при взаимном узнавании макромолекул, обеспечивают специфичность и направленный характер ферментативных реакций, имеют важное значение при взаимодействии клеточных мембран и поверхностей. Физиологические рецепторные процессы, играющие самостоятельную информационную роль в жизнедеятельности организма, также основаны на взаимодействиях макромолекул. Во всех случаях макроинформация возникает исходно в виде конформационных изменений при диссипации части энергии по определенным степеням свободы во взаимодействующих макромолекулах. В результате макроинформация оказывается записанной в виде набора достаточно энергетически глубоких конформационных подсостояний, которые позволяют сохранять эту информацию в течение времени, необходимого для ее дальнейшей переработки. Биологический смысл этой макроинформации реализуется уже в соответствии с особенностями организации биологической системы и конкретными клеточными структурами, на которых разыгрываются дальнейшие процессы, приводящие в итоге к соответствующим физиологобиохимическим эффектам.

7.5. МОЛЕКУЛЯРНЫЕБИОТЕХНОЛОГИИ ДНК

Повышение эффективности биотехнологических процессов зачастую удается достичь целенаправленной модификацией атомной структуры биомолекул. В настоящее время существует множество методов для работы с биообъектами на атомном уровне. Химики владеют мощными методиками для синтеза молекул, состоящих из нескольких десятков атомов. Физики перемещают атомы с помощью атомносиловых микроскопов и захватывают их в оптических лазерных "захватах". Биологи используют богатый набор биомакромолекулярных машин для проведения необходимых исследований.

250

Современные биотехнологические методы постоянно усовершенствуются. Сегодня возможно, модифицируя структуру гена, внести специфические изменения в структуру белковой цепи данного белка, или объединить несколько генов, кодирующих разные белки, образуя в результате синтеза гибридную, химерную, молекулу с комбинированными функциями. Используя такую модификацию генов, стало возможным создавать бактерии, которые должны продуцировать большое количество мутантных или химерных белков. Тысячи академических и заводских лабораторий используют эти методы для медицинских, биотехнологических, биорепарационных и множества других применений. Рассмотрим основные методики, которые использующиеся для дизайна, синтеза и анализа биомолекул сегодня.

Технология рекомбинантных ДНК. Технология рекомбинантных ДНК является ключевой в биотехнологии. Эта технология позволяет конструировать любой белок, просто изменяя структуру гена, кодирующего этот белок. Два природных фермента – рестрикционные ферменты и ДНКлигаза – являются основными" инструментами" технологии рекомбинантных ДНК (рисунок 84). Они позволяют "редактировать" генетический "текст" записанный в ДНК. Рестрикционные ферменты, такие как изображенный на рисунке 84(а ) фермент EcoRI, разрезают ДНК на определенных участках. Как правило (но не всегда), образующиеся фрагменты ДНК имеют "липкие концы" ( рисунок 84(б )). Фермент ДНК-лигаза (рисунок 84(в )) соединяет разъединенную молекулу ДНК. До открытия этих ферментов исследователи модифицировали гены организмов специфически биологическими методами сцепления и кроссинговера генов или методом случайного мутагенеза с помощью химических агентов или ионизирующего излучения. Сегодня исследователи модифицируют структуру генов целенаправленно на атомном уровне.

Рестрикционный ферменты –чрезвычайно полезные белки. Они синтезируются бактериями для защиты от вирусных инфекций. Рестрикционные ферменты разрезают чужую ДНК в специфической области рестрикции, имеющей определенную последовательность

нуклеотидов. В то же время собственные ДНК, имеющие такие же

251

последовательности, модифицируются таким образом (метилируются), что рестрикционные ферменты не разрезают собственную ДНК бактерии.

рестрикционным ферментом, б – "липкие концы" молекулы ДНК, в – ДНК-лигаза. 1 –ДНК ; 2 – фермент; 3 – "липкие" концы

Вирусные же ДНК постоянно разрезаются рестрикционными ферментами. Большинство рестрикционных ферментов разрезают ДНК так, что образуются комплементарные "липкие концы", которые затем могут самопроизвольно соединяться. Помещая затем фрагменты разных ДНК с одинаковыми "липкими концами" в общий раствор мы получим вполне определенный набор слившихся ДНК. Таким образом, рестрикционные ферменты, которые были созданы природой для разрушения, оказались удобным инструментом для редактирования ДНК с атомной точностью.

В настоящее время технология рекомбинантных ДНК находится в расцвете. Непрерывно изобретаются новые методы для использования клеточной механики биосинтеза белков. Соответствующие методы, зачастую в форме коммерчески распространяемых наборов ферментов, доступны в настоящее время практически для всех мыслимых процессов.

252

Можно,например,

•обнаружить или экстрагировать специфический ген из организма,

•дуплицировать и определить структуру большого количества интересующих генов,

•искусственно мутировать, реорганизовать и соединить гены или создать совершенно новый ген, наращивая его нуклеотид за нуклеотидом,

•заменить этими генами исходные гены клетки, изменив, тем самым,генотип клетки.

Методы конструирования ДНК. Создание измененных ДНК –это рутинная лабораторная процедура, которую ежедневно проводят в тысячах лабораторий во всем мире. Объединение биологических методик и методик химического синтеза позволяют конструировать длинные ДНКцепи, состоящие из природных ДНК или же совершенно новые ДНК. Уже сформировалась соответствующая индустрия, которая обеспечивает лаборатории необходимыми компонентами для такой работы. Действительно, можно приобрести фрагменты ДНК, имеющих любую заданную структуру, и все ферменты, необходимые для манипулирования этими фрагментами.

Исследователи используют широкий набор естественных биомолекул для манипулирования ДНК. Четко определенные протоколы использования и коммерческие источники таких ферментов доступны для любой современной лаборатории. Самые важные компоненты перечислены ниже.

1. Рестрикционные ферменты, изолированные из бактерий. Более

100 типов таких ферментов предлагаются коммерческими структурами. Каждый из ферментов разрезает ДНК в специфической области рестрикции. Обычно рестрикционные ферменты состоят из двух идентичных субъединиц, поэтому они симметрично атакуют обе нити спирали ДНК и разрезают ее на специфическом участке, содержащем палиндромную последовательность.

253

2.ДНК-лигаза, соединяющая разрезанные ДНК фрагменты. После того, как " липкие концы" соединятся, ДНК-лигаза достраивает недостающие ковалентные связи для восстановления непрерывной спирали ДНК.

3.ДНК-полимераза синтезирует новую ДНК, используя другую нить

вкачестве матрицы, образуя двойную спираль по одинарной нити. ДНКполимераза используется для заполнения однонитиевых "дыр" и для полного копирования фрагментов ДНК.

Химический синтез фрагментов ДНК. Химический синтез фрагментов ДНК дополняет эти три природные биомолекулярные инструменты манипулирования ДНК. Современные технологии химического синтеза позволяют автоматически формировать фрагменты ДНК длиной до 100нуклеотидов . Сформированные таким образом комплементарные нити ДНК затем гибридизируются, образуя двойные спирали ДНК. Синтез коротких олигонуклеотидов является рутинной компьютеризованной процедурой. Коммерческие организации предлагают на рынке огромное количество синтезированных олигонуклеотидов. После того, как получена необходимая новая молекула ДНК, ее копирование в больших количествах производится с помощью двух основных методик: клонированием ДНК и полимеразной цепной реакцией.

Клонирование ДНК. Термин "клонирование" обозначает процесс получения идентичной копии, минуя нормальные процессы полового размножения –копии мыши или овцы, колонии идентичных клеток, или, в нашем случае, множество идентичных копий данного фрагмента ДНК. Для процесса клонирования ДНК используется бактериальная клетка, которая и осуществляет многократное копирование фрагмента ДНК.

В одном из методов данный фрагмент ДНК помещают в вирус, которым затем заражают бактериальную клетки, стимулируя тем самым процесс многократного копирования. В другом методе используются бактериальные плазмиды –небольшие кольцевые ДНК. Для того, чтобы клонировать фрагмент ДНК, необходимо встроить его в плазмиду, которую затем помещают в бактерию. После этого плазмида копируется каждый раз при клеточном делении, образуя большое количество ДНК по

254

мере роста бактериальной культуры. На рисунке 85представлена схема плазмидного вектора pBR322, который часто используют в биотехнологии с клеткой Escherichia coli. На рисунке показана схема плазмиды, содержащей 4361 пару оснований ДНК. Плазмида содержит ориджин репликации( ori) и два гена, которые кодируют белки, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам, один к ампициллину (ampR), другой к тетрациклину (tetR). По периметру плазмиды указаны местоположение сайты рестрикции, на которые действуют различные рестрикционные ферменты,и обозначение соответствующего рестрикционного фермента.

Рисунок 85 – ПлазмидныйвекторpBR322

Используя соответствующий рестрикционный фермент, плазмида может быть разрезана в определенном месте. Исследователи добавляют в плазмиду новые гены, разрезая плазмиду в одном из сайтов рестрикции. Гены, создающие устойчивость к антибиотикам, обеспечивают четкий метод определения того, содержит ли бактерия такой плазмидный вектор. Например, если новый фрагмент ДНК будет вставлен в PstI сайт

255

рестрикции, то такая вставка разрушит ген резистивности к ампициллину. Поэтому те бактерии, которые содержат новую плазмиду, легко могут быть идентифицированы и отделены от тех бактерий, которые не содержат плазмиду, поскольку они будут резистивны к тетрациклину, но чувствительны к ампициллину.

Полимеразная цепная реакция. Полимеразная цепная реакция

(ПЦР) –это метод копирования небольших фрагментов ДНК (рисунок 86).

Рисунок 86 – Схемаполимеразной цепнойреакции

256

В ПЦР используются достоинства эффективной термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерий, которые живут в горячих вулканических водных источниках и гейзерах. ПЦР работает циклически, удваивая число ДНК в каждом цикле. Процесс начинается с двойной спирали ДНК. Нагревание денатурирует двойную спираль на две однонитиевые ДНК. В систему добавляются короткие праймеры, которые гибридизируются с концами нитей ДНК, и с которых начнется синтез комплементарных нитей. ДНК-полимеразы достраивают комплементарные вторые нити ДНК, используя первые нити в качестве матрицы. В конце цикла из одного фрагмента ДНК получены два фрагмента, идентичных исходному.

Циклы повторяются, удваивая количество ДНК в каждом цикле. Именно использование термостабильных ДНК-полимераз, которые выдерживают тот нагрев, в каждом цикле, которым стимулируется денатурация (расплетание) двойных спиралей ДНК, обеспечивает эффективность ПЦР.

7.6. МОЛЕКУЛЯРНЫЕБИОТЕХНОЛОГИИ БЕЛКОВ

Экспрессионные векторы. После того, когда сконструирована нужная молекула ДНК, необходимо использовать ее для синтеза планируемого белка. Обычно для этого используют экспрессионные векторы – плазмиды, которые содержат синтезированный ген и активный промотор трансляции. Промотор, который обычно берут из вирусов, стимулирует модифицированную клетку синтезировать большое количество мРНК по плазмидному ДНК-вектору.

Наиболее широко используют для этой цели бактериальные клетки. Такие трансформированные клетки синтезируют большое количество нужного белка порядка 1–10%всего белкового содержимого клетки. Кроме того, преимуществом использования бактерий является их простое культивирование, и достаточно дешевые методы ферментации позволяют выращивать большое количество бактериальной культуры, имея скромные ресурсы.

257

Однако использование бактерий имеет серьезные ограничения. Клетки эукариот часто модифицируют синтезированные белки, а бактерии не способны осуществлять такие химические модификации. В частности, многие животные и растительные белки имеют углеводные группы на поверхности (гликопротеины), а бактерии не могут осуществить такое гликозилирование белков. Это может иметь фатальные последствия при синтезе белков для медицинских нужд. Многие из таких

группу крови при переливании, связана именно с различием в строении углеводных цепей, присоединенных к белкам крови разных групп). В случаях, когда необходима соответствующая модификация белков, используют клетки дрожжей, насекомых или млекопитающих.

Другая проблема, которая возникает при использовании бактерий, это то, что белки начинают агрегироваться, когда их концентрация превышает некоторый уровень,образуя белковые включения в клетках.

Такие включения представляют собой плотные белковые агрегаты, различимые в оптический микроскоп и распространяющиеся через всю бактериальную клетку. Они формируются, когда новые белки случайным образом ассоциируются еще до того, как завершится их фолдинг. Белковые включения чрезвычайно прочные и для того, чтобы разъединить их отдельные белковые нити необходимо использовать достаточно суровые и критические внешние условия. Но в большинстве случаев выделенные таким образом индивидуальные полипептидные цепи смогут затем осуществить правильный фолдинг в необходимых условиях. И поэтому, если принципиально возможно выделить впоследствии индивидуальный белок из белкового включения, то само наличие таких включений существенным образом помогает выделению белка из клеток после клонирования.

Поскольку плотность белковых включений намного выше плотности большинства остальных клеточных компонентов, они легко могут быть отделены от остальных клеточных компонентов простым

центрифугированием клеточного экстракта. 258

Бесклеточный синтез. Белки могут быть синтезированы также и без помощи живых клеток. Достаточно собрать вместе те компоненты клетки, которые осуществляют биосинтез белков. Первый этап производства белка – транскрипция ДНК в мРНК – производится с помощью РНК-полимераз. Однако на втором этапе –при синтезе белков на рибосомах – зачастую возникали трудности при использовании клеточного цитозоля in vitro. Такой клеточный экстракт мог не иметь достаточно АТФ, или же присутствовавшие в экстракте цитозоля протеазы и нуклеазы разрушали синтезированные белки или мРНК. Для преодоления этих ограничений были созданы специализированные проточные бесклеточные (cell-free) реакторы.

Также успешными были попытки осуществить синтез белков, изготовив искусственную смесь из предварительно выделенных и очищенных компонентов, необходимых для синтеза. Но из-за сложности такой системы, включающей более 100 биокомпонентов, эти попытки пока ограничились воспроизведением условий синтеза белков в самых простых дрожжах.

Эти эксперименты были проведены в научных, а не в промышленных масштабах. Но те преимущества, которые имеют бесклеточные технологии синтеза белков, делают их разработку чрезвычайно перспективным делом. Именно с помощью таких технологий можно синтезировать такие белки, как мембранные белки, белки-токсины или белки с нестандартными аминокислотами, которые трудно синтезировать в живых клетках бактерий. Разработка бесклеточных трансляционных систем является в настоящее время областью активных исследований молекулярных биологов.

Точечный мутагенез. Во многих случаях нем необходимы небольшие изменения в существующих природных белках, для того, чтобы приспособить их функции к данной задаче. Направленный точечный мутагенез( site-directed mutagenesis) используется для того, чтобы модифицировать аминокислотную последовательность белка, сделав специфические изменения в структуре гена, кодирующего этот белок. В этом случае мы можем сделать изменения с атомной точностью в

структуре белковой цепи, видоизменяя его функции и пространственную

259