3.3. Некоторые примеры использования
полимерных носителей в практике
Трудно представить себе современную лабораторную и производственную деятельность без использования полимерных носителей. Они применяются как ионообменники, носители для эксклюзионной хроматографии, в биохимии и медицине аффинные носители широко используются для разделения сложных смесей белков, для диагностики в иммунологических анализах и т.д.
Для рассмотрения в настоящем пособии наибольший интерес представляет использование нерастворимых полимерных носителей и реагентов в сложном органическом синтезе. Преимущества, которые дает их применение при проведении органических реакций, были впервые сформулированы Меррифилодом в его классической работе 1963 г., посвященной твердофазному синтезу пептидов:
1. Появляется возможность значительного увеличения выхода реакции за счет использования избытка реагентов.
2. Существенно упрощается завершающая стадия реакции — отделение продукта, иммобилизованного на носителе, от избытка реагентов и побочных продуктов. Как правило, это достигается простым фильтрованием и промывкой.
3. Использованные и выделенные из реакции реагенты можно легко регенерировать, что важно с экономической точки зрения.
4. Появляется возможность автоматизировать процесс, что является ценным для использования процесса в промышленных масштабах.
5. Сшитые полимерные носители нерастворимы и нелетучи. Поэтому вещества, на них хемосорбированные, теряют растворимость и летучесть. Это позволяет сделать значительно более безопасной работу с ядовитыми или сильно пахнущими веществами, например, производными серы или селена.
Сходными достоинствами обладают и растворимые поли-мерные носители, однако процедура отделения хемо-сорбированных на них продуктов реакции от избытка реагентов и побочных продуктов значительно сложнее.
Работа Меррифилда дала мощный импульс развитию новой области химии — созданию полимерных носителей и разработке новых принципов их использования. Поэтому рассмотрение примеров использования носителей в органическом синтезе целесообразно начать именно с этой работы.
3.3.1. Синтез пептидов на полимерных носителях
Пептиды, играющие большую роль в жизни организмов в качестве гормонов, регуляторов, передатчиков импульсов и др., представляют собой олигомеры (или полимеры) -аминокислот, соединенных друг с другом амидными связями в определенной последовательности. Синтез пептидов сводится к серии циклов последовательных операций — конденсация двух аминокислот, одна из которых защищена по карбоксильной группе, другая — по аминогруппе, деблокирование (как правило, с аминоконца), депротонирование и конденсация со следующей N-защищенной аминокислотой
Синтез чрезвычайно трудоемок из-за необходимости очистки продуктов от избытка реагентов и побочных веществ на каждой стадии. С ростом пептидной цепи сложности значительно возрастают. В результате суммарный выход при синтезе петидов, содержащих 10 аминокислот, оказывается порядка одного процента в расчете на исходные реагенты.
Суть метода, предложенного Меррифилдом, заключается в присоединении первой с С-кон
Z-NH-CHR1-COOH Z-NH-CHR1-COX
Z-NH-CHR1-CO-NH-CHR2-COOY
NH2-CHR1-CO-NH-CHR2-COOY ит.д.
где Z — защитная группа аминофункции; Rn — боковой заме-ститель при -углеродном атоме аминокислоты; X — электроно-акцепторная активирующая группа; Y — защитная группа карбоксильной функции.
ца синтезируемого пептида защищенной аминокислоты сложноэфирной связью к нерастворимому полимерному носителю, в качестве которого был использован хлорметилированный сополимер стирола с дивинилбензолом. Таким образом, носитель играет роль полимерной защитной группы. Затем действием кислоты производится деблокирование аминогруппы, ее депротонирование и конденсация со следующей защищенной аминокислотой с использованием, например, дициклогексилкарбодиимида (ДЦГИ) (см. схему на с. 91).
При этом полимерный носитель с ковалентно присоединенной к нему растущей пептидной цепью от начала и до конца синтеза находится в одном реакционном сосуде, меняются только реакционные растворы, которые вместе с
Схема синтеза пептидов по Меррифилду.
избытком реагентов и побочными продуктами реакции отделяются от носителя простым фильтрованием и промывкой. Это позволяет использовать значительные избытки активированных производных кислот и добиваться на каждой стадии практически количественных выходов. Стандартный характер производимых с носителем операций дает возможность автоматизации процесса. Меррифилд сконструировал автоматический синтезатор пептидов и провел на нем синтез белка, состоящего из 184 аминокислотных остатков — рибонуклеазы А, при этом синтезированный белок обладал полной биологической активностью. За это достижение Меррифилд был удостоен Нобелевской премии.
Впоследствии принцип синтеза на полимерных носителях был с успехом применен для получения олигонуклеотидов и олигосахаридов с заданной последовательностью нуклеотидов и моносахаридов соответственно.
Вместе с тем, при всех достоинствах твердофазного метода синтеза пептидов со временем обнаружились и его недостатки. По сути такой синтез представляет собой длинную цепь полимер-аналогичных превращений, протекающих в зернах носителя гелевого или микрогетерогенного типа, со всеми вытекающими из этого достоинствами и недостатками.
В первую очередь, недостатки связаны с тем, что выходы на стадии ацилирования не всегда оказываются 100%-ными. В результате накопления ошибок, особенно при синтезе длинных пептидов, целевой продукт может содержать близкие по составу и поэтому очень трудно отделимые “укороченные” пептиды, лишенные в своей структуре одного или нескольких аминокислотных остатков.
Кроме того, рост пептидов может обрываться за счет взаимодействий пептидных цепей как между собой, так и с цепями самого носителя. Получающийся в результате синтеза продукт можно на определенной стадии рассматривать как привитой сополимер со всеми вытекающими из этого последствиями, главным из которых является возможность микрофазового разделения. Сегрегация пептидных цепей в виде твердых микрогетерогенных участков может иметь следствием прекращение их дальнейшего роста из-за невозможности доступа реагентов внутрь таких областей.
Эти недостатки стимулировали поиск новых подходов к использованию полимеров в сложном органическом синтезе. Один из таких подходов — использование носителей, имеющих большее термодинамическое сродство с пептидами. В качестве примеров можно привести носители на основе гидрофильных полимеров — декстрана, полиакриламида и некоторых других.
Другой подход заключается в использовании в качестве носителей растворимых полимеров. Химизм процесса остается тот же, также используются значительные избытки реагентов, однако удаление этих избытков и побочных продуктов реакции производится не фильтрованием, а диализом или многократным переосаждением полимер-пептидного конъюгата после каждой стадии синтеза. Это делает процесс весьма трудоемким и в то же время не устраняет некоторые недостатки твердофазного синтеза, например, возможность взаимодействия пептидных цепей между собой, что ограничивает доступ реагентов к активным центрам даже при синтезе в растворе. Поэтому растворимые носители не нашли широкого практического применения.