А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
устройство для ввода пробы, обработки сигнала и выдачи информации о концентрации определяемого компонента. Достоинствами таких приборов являются малые размеры и масса, небольшая потребляемая мощность, способность работы в автоматическом автономном и непрерывном режиме.
Обычно в состав сенсора входят (рис. 6.1.1):
•распознающий элемент (рецепторный слой) - вещество, способное селективно взаимодействовать с аналитом;
•трансдьюсер (англ. transducer – преобразователь, датчик) – преобразователь химического или биологического взаимодействия в электрический сигнал;
•система сбора и обработки данных.
Рисунок 6.1.1. Состав сенсора.
По принципу работы и в зависимости от вида аналитического сигнала выделяют электрохимические (потенциометрические, вольтамперометрические, кулонометрические, кондуктометрические), оптические (фотометрические, люминесцентные и др.), электрические сенсоры, а также сенсоры, чувствительные к изменению массы и других характеристик.
Воснову работы электрохимических сенсоров положены превращения определяемого компонента в электрохимической ячейке, вырабатывающей аналитический сигнал.
Воптических сенсорах осуществляется измерение поглощения или отражения светового потока, люминесценции или теплового эффекта при поглощении света.
К электрическим сенсорам относятся полупроводники с электронной проводимостью, органические полупроводники и полевые транзисторы. Измеряемыми величинами являются проводимость, разность потенциалов, заряд или емкость, изменяющиеся при воздействии определяемого вещества.
71
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
Действие сенсоров, чувствительных к изменению массы, основано на изменении частоты колебаний пьезореэлементов или скорости распространения акустических волн при селективной сорбции определяемого вещества на электродах или на чувствительной поверхности.
В настоящее время разрабатываются интеллектуальные сенсорные системы (электронный нос и электронный язык), основанные на принципах, сходных с организацией биологических систем — массивов неспецифичных рецепторов с последующим распознаванием образов с помощью аналогов нейронной сети.
Электронный язык - аналитический прибор, состоящий из массива неселективных (перекрестно-чувствительных) химических сенсоров, обладающих перекрестной чувствительностью к различным компонентам в растворе, и методов обработки данных - распознавания образов (искусственные нейронные сети, анализ по главным компонентам, нечеткая логика и т.п.) и многомерных калибровок. Важными характеристиками сенсора являются стабильность отклика и перекрестная чувствительность, которая может быть определена как воспроизводимый отклик сенсора к максимально большому числу компонентов раствора. Откалиброванная мультисенсорная система может быть использована для многокомпонентного количественного анализа растворов, а также распознавания (классификации, идентификации) сложных жидкостей различной природы. Уникальная особенность системы при анализе пищевых продуктов - возможность установить корреляцию между результатами анализа и человеческим восприятием вкуса.
Разновидностью химических сенсоров являются биосенсоры - компактные устройства/приборы, содержащие анализирующий элемент биологической природы (биорецептор), работа которого основана на использовании ферментов, клеток, антител, клеточных рецепторов и т.д., и который сопряжен с физическим преобразователем, проводящим регистрацию сигналов биологического элемента.
Определение по IUPAC: биосенсор - устройство, состоящее из трансдьюсера
и иммобилизованного биологического элемента. 1 этап действия биосенсора: “узнавание” биоэлементом специфического для него вещества из многокомпонентной смеси. 2 этап - преобразование информации о протекании биохимической реакции в форму электрического или другого (например, оптического) сигнала.
Основная область применения биосенсоров - анализ жидких объектов в медицине, биотехнологии, пищевой и химической промышленности.
Недостатками биосенсоров являются: невысокая стабильность, трудность получения биоорганических материалов постоянного состава, чувствительность к действию высоких и низких температур, бактерицидных загрязнений и др.
Кроме очевидных требований, предъявляемых к сенсорам, таких как простота эксплуатации, дешевизна, высокая точность, долговечность, селективность и скорость анализа, добавляются еще требования миниатюризации, возможность работать в непрерывном режиме, а в некоторых случаях – возможность внедрения в человеческий организм.
72
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
Используемые в биосенсорах трансдьюсеры разнообразны. Наиболее часто применяются электрохимические преобразователи, в которых трансдьюсером является электрод, помещенный в исследуемый раствор. Оптические биосенсоры используют явления полного внутреннего отражения, поверхностного плазмонного резонанса, люминесценции. Гравиметрические сенсоры используют изменение массы при связывании аналита и обычно основаны на акустических волнах или пьезокварцевых микровесах.
Биосенсоры удобно классифицировать как по типу трансдьюсеров, так и по типу элемента, осуществляющего “биоузнавание”. Типы трансдьюсеров определяются физико-химическими основами их действия и позволяют разделить биологические сенсоры на основные категории: электрохимические, оптические и гравиметрические.
6.1.2.Основные аналитические характеристики сенсоров. Каталитические и аффинные биосенсоры. Иммобилизация биологического материала.
Каждый сенсор имеет рабочий диапазон температур, давлений и pH. Так как сенсор измеряет концентрацию аналита, то важными характеристиками являются точность,
воспроизводимость, рабочий диапазон измерений. Чувствительность сенсора
показывает отношение аналитического сигнала к концентрации аналита, вызвавшего этот сигнал. Более строго чувствительность определяется как максимальное значение производной величины отклика по концентрации. Важнейшей характеристикой сенсора является селективность, она отражает способность детектировать данный аналит в присутствии посторонних веществ.
Для количественного определения селективности используются два основных метода:
•построение калибровочных кривых для аналита и для посторонних примесей при одинаковых условиях эксперимента. При этом селективность выражается как отношение величины сигнала, вызываемого аналитом к величине сигнала, вызываемой примесью той же концентрации;
•в ячейку, содержащую аналит, вводят примеси в концентрациях, которые ожидаются в реальных образцах, а селективность определяется как изменение сигнала в процентах.
К временным характеристикам сенсоров относятся следующие: время отклика, время жизни и время регенерации. Время отклика – время необходимое для возникновения равновесия между анализируемым образцом и рецепторным слоем. Время жизни – это длительность воспроизводимой работы сенсора, которая ограничена деградацией рецепторного слоя. Время регенерации - это время, требуемое для восстановления работоспособности распознающего элемента.
Наиболее часто распознающими элементами биосенсоров являются ферменты – высокоспецифичные катализаторы биохимических реакций. В состав фермента входит одна или несколько белковых молекул, иногда присутствует небелковая часть. Каталитическая активность ферментов значительно выше, чем у любых искусственных катализаторов, ферменты увеличивают скорость реакции в 103-107 раз.
В некоторых случаях ферменты используются непосредственно в составе тканей организмов животных или растений (иммобилизованные на электроде ткани грибов). К
73
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
биосенсорам на основе тканей идеологически близки устройства с использованием клеток в качестве распознающих элементов.
Биосенсоры, использующие ферменты в рецепторном слое, иногда называют
каталитическими. Существуют аффинные биосенсоры (affinity biosensors),
использующие антитела, нуклеиновые кислоты и рецепторы. В ферментативных сенсорах происходит реакция по общей схеме (рис. 6.1.2):
S + E ↔ ES → E + P
Субстрат S связывается с ферментом E, образуя комплекс ES, затем субстрат превращается в продукт P и высвобождается.
В случае аффинных биосенсоров в рецепторном слое происходит реакция вида:
A + B ↔ AB
Втаких реакциях не образуется новых продуктов, а происходит связывание реагирующих молекул в комплекс АВ. Реакции этого типа также называют реакциями непродуктивного связывания. Акт непродуктивного связывания сложнее зарегистрировать. К аффинным биосенсорам относятся сенсоры на ДНК, на антигены и антитела и сенсоры с использованием рецепторов.
ВДНК-сенсорах рецепторный слой состоит из иммобилизованных одноцепочечных ДНК, которые улавливают из раствора комплементарные цепи. Детектирование молекул ДНК основано на взаимодействии между комплементарными цепями. Природа этого взаимодействия – водородные связи между парами нуклеотидов.
Рисунок 6.1.2. Реакции в ферментативных (а) и аффинных биосенсорах (б).
74
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
Антитела – это сложные белковые молекулы, построенные из нескольких субъединиц, вырабатывающиеся в организмах позвоночных в ответ на проникновение чужеродных агентов (антигенов), например, токсинов, вирусов или чуждых организму макромолекул. Циркулирующие в крови антитела связываются с антигенами, деактивируют их и выводятся из организма. Кроме того, связанные антитела служат метками для микроорганизмов, подлежащих уничтожению. Взаимодействие антиген – антитело считается наиболее селективным для применения в биосенсорах. Это взаимодействие осуществляется теми же по природе силами, что и взаимодействие фермента с субстратом: вандерваальсовыми силами, ионными, гидрофобными и гидрофильными взаимодействиями, водородными связями. Сложность применения антител в биосенсорах состоит в том, что акт связывания антигена сложно зарегистрировать. Это является общим недостатком аффинных биосенсоров и приводит к необходимости применения специальных методов, например, использования меток. Другая сложность состоит в том, что аффинные взаимодействия часто имеют высокие значения константы ассоциации, т.е. слабо обратимы, и использующие их распознающие элементы часто являются одноразовыми или требуют специальных методов регенерации.
Рецепторы – это мембранные белки, способные связывать определенные лиганды и вызывать определенный физиологический отклик в ответ на акт связывания. Рецепторы обычно используются в биосенсорах в составе клеток, так как в очищенном виде они недостаточно стабильны.
Распознающий элемент биосенсора находится в непосредственном контакте с исследуемым образцом, именно он отвечает за химические и биохимические реакции, протекающие в процессе анализа. Наиболее универсальным направлением развития являются биосенсоры, использующие антитела, т.к. могут быть изготовлены для связывания чрезвычайно широкого класса веществ. Существенным является закрепление (иммобилизация) распознающего элемента – биологического материала – на трансдьюсере. Основные требования, предъявляемые к методам иммобилизации:
а) закрепленный биологический материал должен сохранять свою активность в течение как можно более продолжительного времени; б) перенос молекул аналита к распознающему элементу не должен быть затруднен, а если в распознающем элементе осуществляется каталитическая реакция, то должен быть обеспечен отвод продуктов реакции; в) метод иммобилизации должен быть применим в достаточно широких диапазонах температур, значений pH и давлений; г) метод иммобилизации должен обеспечивать хорошую воспроизводимость. Основными методами иммобилизации являются (рис. 6.1.3):
•адсорбция,
•включение в полимер, в частности в гель,
•сшивка,
•ковалентное связывание,
•капсулирование или изоляция с помощью мембран.
Адсорбция является наиболее простым методом, практически не требующим подготовки компонент сенсора и использования специальных химических реагентов. При физической адсорбции частицы удерживаются на подложке под действием сил
75
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
Ван-дер-Ваальса (рис. 6.1.3а), которые по своей природе делятся на диполь-дипольные, индукционные и дисперсионные взаимодействия, а также под действием водородных и ионных связей. Полученные методом адсорбции элементы обычно характеризуются низкой чувствительностью и существенной зависимостью от температуры и pH.
Включение биологического материала в полимерную матрицу является универсальным методом, применимым для разных типов распознающих элементов. Обычно используются такие полимеры, как полиметилметакрилат, крахмал, нейлон, желатин, коллаген и другие. Если матрица состоит из синтетического полимера, его получение проводится в присутствии биологического материала. Обычно добавляется сшиватель, чтобы отдельные полимерные нити объединились в трехмерную сетку. При этом биологически активные молекулы оказываются захваченными внутрь полимера (рис. 6.1.3б). Достоинством этого метода является его универсальность; его недостаток в том, что сетка затрудняет диффузию и мешает проникновению аналита. Кроме того, если включаемые в сетку молекулы не связаны с ней химически, то они могут выходить из нее через поры.
Рисунок 6.1.3. Методы иммобилизации биологического материала
В тех случаях, когда молекулы биологического материала связаны между собой или связаны с опорной сеткой, говорят о методе сшивки. Фактически сшитые распознающие молекулы могут использоваться без подложки, если обладают достаточно хорошими механическими характеристиками (рис. 6.1.3в). Сшивка обычно используется в сочетании с другими методами. Например, она может стабилизировать элементы, полученные адсорбцией.
76
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
Метод ковалентного (химического) связывания является наиболее распространенным в различных приложениях. Он предполагает создание ковалентной связи между биоматериалом и подложкой (рис. 6.1.3г). Выбор химических реагентов для его реализации зависит от типа связываемых молекул и материала подложки. Обычно метод реализуется в три этапа: очистка и модификация поверхности подложки, т.е. формирование на ней слоя из необходимых функциональных групп, затем нанесение биоматериала, и, наконец, смывание слабо закрепленных молекул чистыми растворителями. Материалы подложек, используемые в сенсорах: металлы (золото, серебро, платина), стекло, кремний, углерод, полисахариды, нейлон, полимеры и т.д. Главные достоинства метода ковалентного связывания состоят в том, что, с одной стороны он обеспечивает надежную связь биоматериала с подложкой и предотвращает его утечку, а с другой позволяет создавать сенсоры с длительным временем жизни.
Один из распространенных методов, используемых при создании сенсоров, состоит в том, что ферменты отделены от остального раствора полупроницаемой мембраной, через которую могут проходить молекулы аналита и продукты каталитической реакции (рис. 6.1.3г). Практически ферменты находятся в свободном состоянии, но они локализованы в одной части измерительной ячейки. Этот метод также иногда называется микрокапсулированием.
В ДНК-биосенсорах (еще их иногда называют биочипами) распознающим элементом обычно являются одноцепочечные ДНК, которые связывают комплементарные цепи. Биочипы представляют собой системы различных распознающих элементов, собранные на малой площади; каждый тип распознающих элементов занимает свой участок (сайт). Применительно к ДНК, это означает, что на одной твердой подложке собрано большое количество различных типов одноцепочечных олигонуклеотидов. В процессе анализа каждый из них связывает комплементарный участок молекул из образца. Каждый тип олигонуклеотидов занимает сайт диаметром ~100 мкм; детектирующая система считывания обрабатывает сигналы от разных участков и регистрирует присутствие различных последовательностей в исследуемом образце. Для иммобилизации олигонуклеотидов применяются различные методы, среди которых наиболее популярным является ковалентное связывание на золотой поверхности. При этом используются олигонуклеотиды с привитыми группами –SH, способными непосредственно связываться с золотом. Размещение распознающих элементов на подложке осуществляется тонкими иглами и капиллярами при помощи контактной (pin printing) или бесконтактной (ink-jet printing) микропечати. Малые порции биоматериалов наносятся на определенные точки подложки.
6.2.«Микросистемы полного анализа» и «лаборатория на чипе». Аналитические микрочипы (гибридизационные или матричные, микро- и нанофлюидные, гибридные микрочипы).
В разделе 1.2 уже упоминалось о концепции создания новых аналитических систем - "микроаналитических систем" (μ-TAS – micro-Total Analysis System) и "лабораторий на чипе" (LOC - Lab-on-a-Chip).
Основой таких систем является миниатюрное устройство – аналитический микрочип.
Вобщем случае в аналитическая система на микрочиповой платформе состоит из:
•Микрочипа,
•Вспомогательных устройств,
•Высокочувствительной системы детектирования,
77
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
•Микропроцессора (контроллеры, электроника),
•Программно-математического обеспечения,
•Методик анализа,
•Баз данных.
Существующие микрочипы условно можно разделить на несколько классов:
матричные (гибридизационные), микрофлюидные (к ним же можно отнести и нанофлюидные) и гибридные микрочипы.
Вматричных чипах (биочипах) осуществляется локальная иммобилизация селективно чувствительных веществ (рецепторов) на небольшом участке инертной подложки, что дает возможность проведения качественного, а в некоторых случаях и количественного экспресс-анализа.
Микро/нанофлюидные чипы представляют собой устройства, в которых с помощью современных технологий на небольшой площадке сформированы различные функциональные элементы: смесители, нагревательные камеры, фильтры, реакционные камеры, сепарационные и разделительные устройства, камеры сбора фракций, датчики, насосы и т.п. В этих устройствах обеспечена возможность проведения манипуляций с изучаемым объектом - пробой: ввод, дозирование пробы, перемешивание, смешивание с реагентами, специфические реакции, разделение полученного продукта на компоненты, сбор разделенных компонентов, обнаружение и регистрацию компонентов.
Вгибридных микрочипах пытаются объединить достоинства матричных чипов (высокая селективность и экспрессность определения) и преимущества микрофлюидных чипов (проведение измерений в непрерывном режиме, расширенные манипуляции с пробой и т.д.).
6.3.Биочипы. Получение гибридизационных микро- и наночипов. Принципы функционирования. Протеомный анализ.
Биочип - это микроматрица различных соединений, главным образом биополимеров, иммобилизованных на поверхности стекла, в микрокаплях геля, в микрокапиллярах и т.п. Эффективность биочипов обусловлена возможностью параллельного проведения огромного количества специфических реакций и взаимодействий молекул биополимеров, таких как ДНК, белки, полисахариды и др. Биочип позволяет получить огромное количество биологической информации.
На пластине биочипа наносится до нескольких тысяч различных микротестов (биологические макромолекул - ДНК, белков, ферментов), способных избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе. Обычно технология биочипа основана на принципе высоко специфического взаимодействия нуклеиновых оснований. В ходе реакции происходит взаимодействие комплементарных цепей ДНК: одна из них (ДНК-проба) с известной последовательностью нуклеотидов зафиксирована на подложке, а другая одноцепочечная ДНК-мишень (зонд), меченная флуоресцентной меткой, вносится в ДНК-чип. На рис. 6.3.1 показан принцип действия ячейки ДНК или олигонуклеотидного биочипа, основанный на комплементарных взаимодействиях основания аденина (А) с тимином (Т) или/и гуанина (G) с цитозином (С) в двух нитях ДНК. Если последовательность оснований в одной нити ДНК (или олигонуклеотида) полностью комплементарна последовательности другой нити, то образуется стабильная двухнитчатая спираль - дуплекс. Однако присутствие в дуплексе даже одной неправильной пары, например G-G, предотвращает образование дуплекса. Если иммобилизовать в одном из элементов микрочипа специфическую
78
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
одноцепочечную ДНК или, положим, олигонуклеотид (пробу) содержащий 20 оснований, то при добавлении к микрочипу меченных флуоресцентными красителями фрагментов ДНК, например генома человека, будет происходить их высокоспецифичное взаимодействие. Заданный олигонуклеотидный элемент биочипа специфически свяжет только одну комплементарную последовательность из 420≈1.09H1012 всех возможных последовательностей этой длины в ДНК. В результате флуоресцентное свечение наблюдается только на этом комплементарном элементе биочипа. Таким образом, один элемент биочипа производит одну выборку примерно из множества возможных вариантов.
Рисунок 6.3.1. Принцип функционирования ДНК-биочипа.
Стандартный процесс получения биочипов иллюстрируется рис. 6.3.2.
Развиваемые в последние годы биологические микрочипы позволяют реализовать в доступной форме сложные подходы геномики, протеомики и методов анализа клетки.
Детектирование происходящих на биочипах процессов осуществляется с помощью флуоресцентных, хемилюминисцентных и масс-спектрометрических методов.
Хемилюминисцентные методы, хотя и уступают по чувствительности люминесцентным, позволяют значительно упростить и удешевить регистрирующую аппаратуру. Кроме того, разработан специальный метод прямого анализа соединений непосредственно в гелевых элементах с помощью специальных методов массспектрометрии. Этот важный в протеомике метод позволяет проводить дополнительную идентификацию взаимодействующих с биочипами соединений по их массе.
Детекция сигнала осуществляется специально разработанными флуоресцентными сканерами. Например, система детекции компании Affymetrix - лазерное конфокальное сканирующее устройство (НP), позволяющее регистрировать участки чипа с
79
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
разрешением в несколько мкм. Система детекции Genetic MicroSystems имеет разрешающую способность ~ 10 мкм и чувствительность ~ 1 молекула флуоресцентного красителя на 1 мкм2.
Характерные размеры ячеек микрочипов лежат в интервале от 50 до 200 мкм, объемы отдельной ячейки от 1 нл до 1 мкл, значения характерных концентраций анализируемых макромолекул в пределах 1 пM−10 мкM. Общее число ячеек на чипе ~ 103−105, линейные размеры чипа ~1 см.
Рисунок 6.3.2. Основные стадии изготовления биочипов.
Протеомный анализ.
Слово "протеом" образовано от слова "протеин" (белок) и окончания слова "геном", так что в самом названии как бы слиты воедино белок и геном. Протеом - набор белков данной клетки в данной фазе ее развития в данный момент времени - меньше генома по общему объему информации.
Протеом - понятие динамическое, тогда как геном стабилен и постоянен, иначе было бы невозможно передать наследственные свойства от поколения к поколению, обеспечить сохранение видов и т.д.
Белки (протеины, полипептиды) — высокомолекулярные органические вещества, состоящие из соединённых в цепочку пептидной связью аминокислот. В живых организмах аминокислотный состав белков определяется генетическим кодом, при синтезе в большинстве случаев используется 20 стандартных аминокислот. Множество их комбинаций дают большое разнообразие свойств молекул белков. Кроме того, аминокислоты в составе белка часто подвергаются посттрансляционным модификациям, которые могут возникать и до того, как белок начинает выполнять свою функцию, и во время его «работы» в клетке.
Протеомика - изучение белков и их взаимодействия в живых организмах, в том числе, в человеческом. Часто можно прослеживать связь между изменениями протеинов и их взаимодействием и болезненными состояниями. Таким образом, протеомика может значительно ускорять разработку эффективных лекарственных средств. Сегодня более 95% всех фармакологических средств на рынке нацелены на воздействие на протеины. Протеины служат для выполнения огромного числа функций в организме. Например: энзимные протеины служат катализаторами таких функций как пищеварение;
80