А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
выглядит как яркое пятно, окруженное системой концентрических колец (такое распределение интенсивности описывает цилиндрическая функция Бесселя, и поэтому сами пучки называют бесселевыми). Существуют технические способы превращения гауссова пучка в бесселев, основанные на использовании конических линз, голограмм или пространственных модуляторов света. Бесселеву пучку присущи полезные свойства, которые используются для оптического пинцета – среди которых способность пучка захватывать частицы, разнесенные на расстояние до нескольких мм.
Новые возможности открывает техника оптического пинцета перед химиками, биологами и биофизиками, поскольку принципы захвата атомов применимы к частицам микронных размеров, например, полистирольным шарикам, которые можно присоединить к одиночным молекулам. Профессор С. Чу изучал таким способом мышечное сокращение на молекулярном уровне, упругие свойства ДНК и другие биополимеры. При экспериментах с отдельными молекулами ДНК, обычно концы молекул химически модифицируют, и один из них фиксируется на поверхности или микрочастице полимерного носителя. Второй присоединяется к поверхности полимерной частицы, но не фиксируется, и с незакрепленным концом производят эксперименты, удерживая его оптическим или магнитным пинцетом. Это дает возможность прилагать к индивидуальным молекулам ДНК внешнюю силу. В результате были изучены структурные переходы двойной спирали ДНК.
При воздействии на биологические объекты важно, чтобы частица, которая будет поймана в ловушку, являлась прозрачной для лазерного излучения, поскольку поглощение света приводит к нагреву и, следовательно, к оптическому повреждению образца. Биологические частицы поглощают излучение в ультрафиолетовом и видимом спектральном диапазоне поэтому, для захвата биологического материала часто выбирается область ближнего инфракрасного диапазона (700-1300 нм), так как дальний инфракрасный диапазон поглощается частицами воды.
Сочетая метод оптического пинцета с использованием других лазерных пучков, можно, например, захватить отдельную частицу и разрезать ее на кусочки для дальнейшего анализа. Для захвата частиц часто применяют инфракрасное излучение с длиной волны λ=1,064 мкм, а вторую гармонику этого излучения - зеленый свет (λ=0,532 мкм) – можно использовать для разрезания частиц: биологические объекты почти прозрачны в инфракрасной области, но сильно поглощают зеленый свет.
Для успешного использования «лазерного пинцета» необходимо точно подбирать мощность излучения, создающую необходимую силу захвата. Но воздействие лазерного излучения приводит к изменениям, происходящим в биологических микрообъектах, что требует особого тщательного изучения. В литературе приводятся достаточно скудные данные о зависимости силы захвата от мощности лазерного излучения и о влиянии излучения на биологические объекты.
Микрочастицы, захваченные в фокусе лазерного луча, имеют склонность вращаться. Угловой момент вращения может быть обусловлен как самим светом (поляризация, фазовая структура), так и свойствами захваченной частицы. Используя этот эффект можно измерить упругость скручивания молекулы ДНК, измерять микроскопическую вязкость, манипулировать микроскопическими объектами.
К достоинствам методов управления движением частиц с помощью световых полей следует отнести высокую эффективность их воздействия на частицы и простоту реализации методов в микрочиповых устройствах. Наиболее привлекательными для решения целого ряда задач являются комбинированные методы, использующие, например, диэлектрофорез и технику оптического пинцета, диэлектрофорез и фотофорез (или оптофорез).
61
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
Одной из проблем, возникающей при применении оптического пинцета, является недостаточная изученность влияния лазерного излучения на биологические объекты, что создает дополнительные трудности при использовании излучения для управления и анализа биочастиц. Световые поля могут вызывать фототепловой эффект, который может приводить к сильному нагреву и даже к повреждению образца. Поэтому, важно учитывать этот эффект, соответствующим образом выбирая длины волн воздействующего излучения. С другой стороны, фототепловой эффект, так или иначе оказывает дополнительное влияние на частицы, что также необходимо учитывать, например, в случае фотофоретического разделения частиц. Трудности возникают при использовании техники оптического пинцета для манипуляций с объектами, размеры которых меньше длины волны зондирующего излучения. Существуют также ограничения, определяющие минимальный диаметр светового пятна при фокусировке лазерного излучения.
5.3.Управление движением частиц с помощью магнитных полей.
Магнитофорез (Magnetophoresis).
Магнитная сортировка и извлечение частиц носит название – магнитофорез. В основе этого процесса лежит явление направленного движения частиц с магнитными свойствами в магнитном поле.
В 1950 году Крик и Хьюис сообщили о первой демонстрации технологии магнитного пинцета в биологии. Они использовали малые магнитные частицы в комбинации с большими постоянными магнитами для тестирования физических свойств клеток. С тех пор как макроскопические, так и микроскопические магнитные пинцеты широко используются благодаря своим низкой стоимости и разносторонним возможностям. Они применяются, в частности, для перемещения феррожидкостей, для тестирования среды, окружающей клетку.
Комбинируя множества магнитов, можно создавать сложные магнитные поля даже в размере микрона. В этом контексте важно дифференцироваться между гомогенными и неоднородными магнитными полями. В гомогенном магнитном поле плотность линий потока постоянна, нет градиента в плотности потока, а в неоднородном магнитном поле - градиент в плотности линий потока по расстоянию x. Неоднородные области с высокими магнитными полевыми градиентами желательны, когда необходимо заманить в ловушку частицы или транспортные материалы в пределах малых объемов жидкости. В практике применяются магниты разной формы или даже слоистые структуры (рис. 5.3.1).
62
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
Рисунок 5.3.1. Магнитные поля постоянных NdFeB магнитов (http://www.femm.fostermiller.net): a) гомогенное поле на расстоянии 1 мм от поверхности магнита; b)
неоднородное поле на расстоянии 100 мкм от игольчатого магнита; c) магнитное поле с локальными минимумами и максимумами на 100 мкм расстоянии, чередование железных и алюминиевых блоков.
Существуют магниты двух разных видов: постоянные магниты, изготовляемые из «магнитно-твердых» материалов и электромагниты с сердечником из «магнитномягкого» железа. Если в первом случае магнитные свойства не связаны с использованием внешних источников или токов, то во втором случае создаваемые магнитные поля обусловлены тем, что по проводу обмотки, охватывающей сердечник, проходит электрический ток. Постоянные магниты сохраняют магнитные свойства, при удалении внешнего поля намагничивания.
По своим магнитным свойствам все вещества можно разделить на три класса в зависимости от их магнитной восприимчивости χ. К первому относятся вещества с резко выраженными магнитными свойствами, подобными свойствам железа – ферромагнитные, их магнитное поле заметно на значительных расстояниях. Во второй класс попадают вещества, называемые парамагнитными, магнитные свойства их в общем аналогичны свойствам ферромагнитных материалов, но гораздо слабее. К последнему, третьему классу относятся так называемые диамагнитные вещества. Они отталкиваются электромагнитом, т.е. сила, действующая на диамагнетики, направлена противоположно той, что действует на ферро- и парамагнетики.
Магнитная восприимчивость вещества или среды характеризует связь между намагниченностью вещества М и напряженностью магнитного поля Н в этом веществе:
χ= MH . Часто пользуются также дифференцированной магнитной восприимчивостью
χ= dM/dH.
Диамагнитные материалы (χ<0) ослабляют магнитное поле. Большинство материалов – слабо диамагнитные, включая воду, белки, ДНК, клетки, полимеры, древесину и стекло. Иногда такие материалы называют немагнитными. Отрицательная намагниченность, связанная с диамагнетизмом обычно невелика (χ=10-8–10-4). В отсутствии внешнего магнитного поля молекула не обладает магнитным моментом:
63
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
магнитные моменты диамагнетиков взаимно скомпенсированы. Под действием магнитного поля электроны в заполненных электронных оболочках начинают прецессировать (электронная пресессия – может быть рассмотрена как круговой ток), а их движение электрического заряда вызывает магнитное поле, которое по правилу Ленца направлено так, чтобы уменьшить воздействие внешнего поля.
Парамагнитные материалы (χ>0) усиливают магнитное поле и испытывают небольшие силы при воздействии магнитных полей. Примеры парамагнитных материалов: кислород, платина и т.д. Парамагнетизм обусловлен неспаренными электронами, их собственный магнитный момент (спин) не уравновешен, спины же спаренных электронов направлены в противоположные стороны и уравновешивают друг друга. В магнитном поле спины стремятся выстроиться по направлению поля, усиливая его. Но этот порядок может нарушаться тепловым движением. Т.е. парамагнитная восприимчивость зависит от температуры – чем ниже температура, тем выше значение χm. В простейшем случае это выражается зависимостью, которая
называется законом Кюри: χ = CT или законом Кюри-Вейсса: χ = T C−ϑ ,
где С – константа Кюри, θ - поправка Вейсса.
Диа- и парамагнетики слабо реагируют на внешнее магнитное поле. Но существуют вещества, способные сильно намагничиваться даже в небольших полях – ферромагнетики.
Ферромагнитные материалы (железо, кобальт и никель) имеют χ>>0 и значительно усиливают внешнее магнитное поле. Зависимость намагниченности M от напряженности магнитного поля H у ферромагнетиков оказывается нелинейной, т.к. магнитная восприимчивость у ферромагнетиков не является константой и зависит от H (χ достигает 104 – 105). Степень намагничивания ферромагнитного вещества можно характеризовать не только вектором намагниченности М, но и величиной магнитного
поля в данном веществе (вектором магнитной индукции В):
B = μ0 (H + M ).
В случае, когда намагниченность М пропорциональна Н ( M = χH ):
B = μ0 (1+ χ)H = μ0 μH , μ=(1+χ) – магнитная проницаемость вещества, μ0 -
магнитная постоянная.
Другой случай парамагнетизма - суперпарамагнетизм. Суперпарамагнитные частицы имеют ядро маленьких железных окисных кристаллов, заключенных в оболочку полимера. Частицы намагничиваются магнитным полем. Однако, они не имеют никакой магнитной памяти. Как только внешнее поле удалено, частицы повторно рассеиваются и ведут себя подобно немагнитному материалу.
Постоянные магниты, используемые в микрофлюидике - обычно небольших размеров из сплава (Nd-Fe-B) с высоким удельным магнитным потоком у поверхности полюса. Это позволяет осуществлять манипуляции с магнитными частицами или клетками внутри микроканала, даже если магнит помещен на расстоянии в несколько мм от канала.
Проблема, связанная с применением электромагнитов – значительные размеры и большое количество джоулева тепла, выделяемое при работе.
Для транспортировки пробы в микрофлюидике используются магнитные частицы с размерами от несколько нм до сотен мкм. Большинство таких частиц - суперпарамагнитные, то есть они не имеют магнитной памяти. Коммерчески доступными являются также различные типы магнитных частиц с модифицированной поверхностью. Некоторые компании предлагают магнитомеченные биомолекулы
64
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
(www.dynalbiotech.com, www.micromod.de, www.bangslabs.com, www.polysciences.com, www.seradyn.com, www.estapor.com ).
Магнитные жидкости или феррофлюиды - другой класс материала, который может использоваться в микрофлюидных устройствах. Феррофлюид - устойчивая добавка магнитных наночастиц в жидкость типа воды или органического растворителя. Частицы покрыты специальным материалом, чтобы предотвращать их скопление. Феррофлюиды могут быть перемещены через каналы и принимать любую геометрию. Даже в интенсивных магнитных полях они сохраняют текучесть.
5.3.1. Основные принципы магнитофореза
Потенциальная энергия частицы объемом V и объемной магнитной восприимчивостью χp под действием магнитного поля B может быть выражена как:
U = − |
χp − χm |
VB2 , где μ0 - вакуумная магнитная проницаемость, χm и χp – |
|
||
|
2μ0 |
|
объемная магнитная восприимчивость среды и частицы.
Магнитная сила, действующая на частицу:
F =−gradU= χpμ−χm V(B )B.
Если сферическая частица движется в жидкости, то она испытывает силу сопротивления (Стокса), а в случае равномерного движения магнетофоретическая скорость:
v= 2 χpμ−ηχm r2 (B )B .
9 0
Магнитофоретическая скорость непосредственно пропорциональна (χp-χm), r2, и градиенту магнитного поля (B )B.
5.3.2. Магнитные частицы
Типичная магнитная наночастица, используемая в биологических и медицинских исследованиях, состоит из магнитного ядра, окруженного немагнитным покрытием для селективного закрепления биообъекта (например, клетки, белка, или ДНК фрагмента). В качестве ядра применяются наночастицы диаметром (5-100) нм окиси железа (Fe3O4, γ-Fe2O3). Кривая намагничивания ансамбля таких супермагнитных частиц должна быть без гистерезиса (по крайней мере, при не слишком высоких частотах), что является важным требованием при аналитическом и транспортном применении магнитных частиц.
Большие магнитные частицы (0.5-5 мкм в диаметре) могут иметь отдельное магнитное ядро или ядро из нескольких магнитных взаимодействующих наночастиц в немагнитной матрице (рис. 5.3.2a). Такие частицы имеют гистерезисную характеристику намагничивания (рис. 5.3.2b). Это означает, что после удаления поля они держат намагничивание отличное от нуля Mrem, приводя к кластерам магнитных бусинок (группировке) (рис. 5.3.2c).
65
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
Рисунок 5.3.2. Магнитные наночастицы и их свойства.
Во многих применениях, магнитно-меченный материал отделяется от жидкости при пропускании смеси через область с градиентом магнитного поля.
Рассматривая частицу радиуса r в жидкой среде, движущуюся под действием потока, и предполагая, что магнитное поля вызывает силу, при которой частица может противостоять этому потоку (остановлена магнитной силой, что соответствует максимальной величине скорости, которая может быть вызвана магнитной силой в статической жидкости), для скорости частицы можно получить:
v = |
2r2 χ(B )B |
= |
1 |
ζ (B )B , где ζ ≡ |
2r2 χ |
= |
Vχ |
- магнитофоретическая |
||
9μ η |
μ |
0 |
9η |
6πrη |
||||||
|
|
|
|
|
||||||
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
||
подвижность частицы, характеризующая способность движения частицы под действием магнитного поля
5.3.3. Применения магнитофореза.
А) Феррофлюидные материалы могут использоваться при создании магнитных насосов для прокачки жидкости. Пример конструкции такого насоса приведен на рис. 5.3.3. В микрофлюидный канал введена магнитная жидкость, часть которой располагается напротив неподвижного магнита М. Второй магнит двигается по окружности, вовлекая в движение часть феррофлюидной жидкости, которая, в свою очередь, двигает жидкость в канале. Таким образом осуществляется циклическая прокачка жидкости в канале.
Б) Магнитные поля могут применяться при транспортировке магнитных частиц в микроканалах. Магнитные частицы перемещаются от одного полевого максимума до следующего. В первых микрофлюидных конструкциях, проба с микрочастицами перемещалась по каналу последовательным переключением нескольких внешних электромагнитов, тот же самый принцип использовался в меньшем масштабе, чтобы транспортировать частицы вдоль перемещающихся проводов из проводящего материала (золота) (рис. 5.3.4 a). Магнитные поля с выраженными максимумами были получены с пилообразной формой электродов, изготовленных из золота (рис. 5.3.4 b). Переключая ток между проводами с некоторой частотой можно перемещать частицу от одного элемента к другому со скоростью в несколько десятков мкм в сек. Петли и
66
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
решетки из проводов также могут быть применены для перемещения магнитных частиц размером около нескольких мкм (рис. 5.14 с).
Рисунок 5.3.3. Принцип действия феррофлюидного насоса.
Г) Микрофлюидный чип с H-топологией каналов может использоваться для магнитного разделения частиц. Примеры таких конструкций приведены на рис. 5.3.5. Включение и выключение электромагнитов А и Б приводит к перераспределению частиц между каналами, и таким образом могут быть отделены и изолированы выбранные частицы. Другое устройство с двумя входными каналами, переходящими в более широкий канал, который разветвляется в два выходных канала, предложено для разделения магнитных частиц (рис. 5.3.5 b). Поток с частицами вводится в одно из входных отверстий, а в другое – буфер, потоки выводятся через противоположные отверстия. Без магнитных сил эти два потока оставались несмешанными и выходили через соответствующие выходные каналы. Градиент магнитного поля вызывал отклонение магнитных частиц в «нижний» канал с буферным раствором, а немагнитные следовали по начальной траектории.
Д) Непрерывный метод разделения в потоке, позволяющий отделить магнитные частицы от немагнитных или отделить различающиеся магнитные частицы от друг друга, назван магнитофорез в свободном потоке на чипе. Ламинарный поток смеси частиц буферным раствором переносится в камеру, где создан градиент магнитного поля перпендикулярно к направлению потока (рис. 5.3.6 а). Немагнитные частицы в магнитном поле не меняют траекторию, а магнитные частицы, меняя траекторию, перемещаются к другим выходным каналам (рис. 5.3.6 b). Отклонение частицы зависит от ее магнитной восприимчивости и размера. Магнитофоретическая скорость пропорциональна объемной магнитной восприимчивости микрочастицы. Следовательно, измеряя скорость можно определять магнитную восприимчивость, и получать большее количество информации.
67
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
Рисунок 5.3.4. Транспортировка магнитных частиц путем изменения электромагнитных полей во времени.
Рисунок 5.3.5. Конструкции микрофлюидных чипов с H-топологией: a) для изоляции частиц в отдельные потоки и b) для непрерывного разделения частиц.
68
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
Рисунок 5.3.6. Принцип магнитофореза в свободном потоке.
5.4.Электромагнитофорез (Electromagnetophoresis)
Электромагнитофорез - явление, при котором частицы в растворе электролита мигрируют в перпендикулярном направлении и к магнитному полю и электрическому току при пропускании электрического тока через жидкость. Общая концепция электромагнитофореза - применение силы Лорентца для анализа перемещения.
Если ток плотностью j течет через проводящую жидкость объема V перпендикулярно к магнитному полю, жидкость испытывает действие силы Лорентца:
F = μ0μHjV , где μ0- вакуумная магнитная проницаемость, μ - магнитная проницаемость жидкости и H – напряженность магнитного поля.
Если сила, проявляющаяся в жидкости равна силе действующей на частицу, то перемещения нет, но различие сил вызывает перемещение частиц. Силы, действующие на частицу (рис. 5.17) называются электромагнитным весом (EMW) и
69
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
электромагнитной плавучестью (EMB). Сила электромагнитофореза, действующая на частицу в закрытой ячейке с внутренней площадью S:
|
|
|
|
σP −σ f |
|
i |
|
F |
= F |
+ F |
= 2BV |
|
|
|
, где B - магнитная плотность потока, |
|
|
||||||
EMP |
EMW |
EMB |
|
|
|
S |
|
|
|
|
|
σP + 2σ f |
|
||
σp - электрическая проводимость частицы, σf - электрическая проводимость среды, и i
– сила тока. Электромагнитофоретическая скорость (VEMP) сферической частицы в жидкости выражается:
4 |
|
σ p −σ f |
|
|
iBr2 |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
vEMP = 9 |
|
σ |
|
+ 2σ |
|
SηC |
, где η - вязкость жидкости, r - радиус сферической |
||
|
|
|
|
p |
|
f |
W |
||
частицы и Cw – коэффициент вязкости у поверхности канала.
Рисунок 5.4.1. Силы, действующие на частицу в электрическом и магнитном полях.
6. Анализ биологических проб. 6.1.Сенсоры и биосенсоры.
6.1.1. Сенсоры и биосенсоры. Трансдьюсеры. Мультисенсорные системы.
Сенсоры химические (от лат. sensus - чувство, ощущение) - чувствительные элементы небольших размеров, генерирующие аналитический сигнал, зависящий от концентрации определяемого компонента в анализируемой смеси. Неотъемлемая часть химических сенсоров – преобразователь энергии химических, биохимических или физических процессов, лежащих в основе определения, в электрический сигнал.
Химические сенсоры предназначены для прямого определения конкретного химического вещества в заданном диапазоне содержаний при фиксированных способах введения пробы и обработки полученной информации. Они могут входить в состав аналитических приборов или других контрольно-аналитических систем, включающих
70