5 курс / евстрапов / 0364109_90FD6_evstrapov_a_a_nanotehnologii_v_ekologii_i_medicine_kurs_lekc

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Скорость ЭОП зависит от плотности отрицательного заряда на поверхности канала и, следовательно, от рН раствора. Обычно ЭОП наблюдается при рН>2.5, чем выше рН тем больше скорость ЭОП. Путем химической модификации поверхности канала ЭОП можно уменьшить, подавить или даже повернуть в противоположном направлении.

Если бы ЭОП не было, то при приложении напряжения все положительно заряженные ионы двигались бы к катоду, отрицательно заряженные – к аноду. Однако ЭОП вызывает перемещение к катоду всего объема раствора.

Электроосмотическая подвижность определяется как отношение величины электроосмотического потока к напряженности электрического поля: μEO = εεη0ζ .

Поток через сечение канала Ach, вызванный ЭО: W = AchuEO , этот поток переносит заряд, тем самым, определяя осмотический ток:

I = AchuEOσ0 , где σ0 – электрическая проводимость раствора.

εζ

Движение потока ионов через канал вызывает: образование внешнего потенциала V и создает перепад давления в канале p. Для достаточно больших цилиндрических каналов радиуса a (λD<<a) можно записать следующее уравнение переноса потока:

потенциалов.

Если предположить равновесие и что поток в существенном объеме в каналах не переносится, а движутся только ионы, то получим выражение для оценки ЭО давления:

На все частицы в буфере, перемещающемся под влиянием электрического поля, действует ЭОП. Сам поток не является причиной разделение молекул в растворе. Однако, присутствие электрического поля приводит к направленному движению заряженных аналитов в буфере, это явление известно как электрофорез.

В наноканалах, когда размер канала соизмерим с толщиной ДЭС, наблюдается ряд явлений, приводящих к формированию профиля потока скоростей отличного от плоского (рис. 4.1.3).

41

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Рисунок 4.1.3. Профили скоростей формирующиеся в микро- и наноканалах.

ЭОП является эффективным средством для прокачки жидкостей. Если стенки микроканала имеют электрический заряд, то вблизи поверхности стенок формируется двойной электрический слой встречных ионов. При приложении электрического поля ионы в двойном слое движутся к электроду противоположной полярности. Это создает движение жидкости около стенок и через вязкие силы происходит движение остальной жидкости. Если канал открытый вблизи электродов, то скоростной профиль однороден поперек ширины канала. Однако если электрическое поле приложено в закрытом канале (или существует противодавление), то формируется более сложный профиль - жидкость по центру канала перемещается в направление противоположному перемещению жидкости у стенок. В закрытых каналах, скорость по центру канала может достигать 50 % скорости у стенок.

4.2. Электрофоретическое разделение проб. Электрофоретическая подвижность.

Электрофоретические методы, идеально поддающиеся автоматизации, применяются для разделения биологических молекул в однородном электрическом поле (ионы, белки, ДНК). В основе метода лежит явление миграции ионов, т.е. их движения в электрическом поле. Классический метод электрофореза (Тизелиус А., нобелевская премия 1948г.) реализован как процесс перемещения ионов вблизи границы контакта двух растворов – исследуемого и буферного. Следующая модификация метода – электрофорез на носителе (бумага или гель): здесь ионы перемещаются в неподвижном слое носителя, пропитанного раствором инертного электролита. Исследуемый раствор наносят узкой полосой вблизи одного из концов носителя. В процессе электрофореза различные ионы образуют отдельные зоны - зонный электрофорез. И, наконец, современным методом анализа широкого круга объектов является капиллярный электрофорез. Метод капиллярного электрофореза (КЭ) основан на разделении компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля.

42

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

На заряженную сферическую частицу (с зарядом Ze) в жидкой среде (с вязкостью η) и в электрическом поле напряженностью E будут действовать следующие силы: электростатические (FEP) и силы сопротивления в потоке (FD). Если частица движется равномерно, то:

F= FEP + FD = ZeE + 6πηauEP = 0 ,

аскорость движения можно определить как:

uEP = 6πηZea E = μEP E , где a – радиус частицы, uEP – скорость движения частицы, μEP

–электрофоретическая подвижность.

Электрофоретическая подвижность является величиной, характерной для данного вещества и позволяет соотнести заряд частицы с ее гидродинамическим размером (пропорциональным массе частицы). Различают абсолютную и относительную электрофоретическую подвижность. Абсолютная электрофоретическая подвижность – соотношение скорости частицы к напряженности электрического поля, вызывающей движение частицы. Относительная электрофоретическая подвижность – это отношение подвижности исследуемого вещества к подвижности другого вещества, принятого за стандарт.

Если в растворе имеются частицы разных размеров и с разными зарядами, то они будут двигаться в постоянном электрическом поле с различными скоростями:

ui = Eμi , где μi – подвижность i-го иона.

В случае, когда требуется разделить два вещества А и В с различными подвижностями, то приблизительное значение требуемой длины канала (капилляра) Lr может быть найдено по формуле:

разделяемых ионов.

Здесь под термином «пробка» пробы подразумевается некоторый объем жидкости с анализируемым образцом, который под действием различных сил перемещается по каналу.

При приложении внешнего электрического поля образуются два независимых и различных потока – электроосмотический (движение потока буфера и находящихся в нем частиц аналита) и электрофоретический – перемещение заряженных молекул аналита. Незаряженные частицы движутся с одинаковой скоростью и не могут быть разделены. Однако их разделение становится возможным, если ввести в раствор поверхностно-активные вещества, образующие мицеллы (например, додецилсульфат натрия). В водных растворах ядро мицеллы гидрофобно и может захватывать нейтральные молекулы. Внешний слой мицелл заряжен. Поэтому в электрическом поле мицелла перемещается унося с собой захваченную молекулу. Такой метод разделения веществ получил название мицеллярной электрокинетической капиллярной хроматографии.

Так как в растворе пробы содержится много аналитов, то положительно заряженные аналиты будут двигаться быстрее, чем общий поток, потому что они притягиваются к

43

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

катоду. Перемещение анионов будет отставать от движения общего потока, так как они будут притягиваться к аноду, но они фактически не двигаются туда, а просто сопротивляются ЭОП (рис. 4.2.1).

Электроосмос и транспортный электрофорез прямо пропорциональны напряженности электрического поля, а их суперпозиция называется электрокинетическим потоком. Идеальный электрокинетический поток - случай объединенного транспорта, в котором электрокинетическое поле скорости (uEK) пропорционально локальному электрическому полю (E):

uEK = μEK E =uEO ± uEP = (μEO ± μEP ) E , где μEK, μEO, μEP - электрокинетическая, электроосмотическая и электрофоретическая подвижности.

В идеальном электрокинетическом потоке частицы движутся вдоль линий электрических полей.

Факторы, влияющие на величину скорости, и в некоторых случаях, на направление ЭОП: pH, концентрация, температура, величина дзетапотенциала, вязкость, и т.д. Температурные изменения, наиболее часто связываемые с Джоулевым теплом, из-за больших напряжений в каналах, порождают дополнительные потоки, искажающие распространение «пробки» пробы.

Рисунок 4.2.1. Движение положительно заряженной (А), нейтральной (В) и отрицательно заряженной (С) частиц в канале (а) и примерное распределение частиц по размерам и заряду (б).

Одно из преимуществ электрокинетического потока - клиновидный скоростной профиль, что позволяет избежать неоднородностей и нелинейностей потока, которые присущи при управлении давлением. Преимуществом является и относительная простота управления электрокинетическими потоками. Однако необходимость высоких напряжений приводит к нагреву жидкости, и, следовательно, изменению свойств потока. Другое неудобство электрокинетического потока – зависимость его характеристик от свойств поверхности, которые могут меняться при адсорбция веществ на поверхность канала. Особенно это касается биологических проб.

4.3. Особенности вклада составляющих электрического поля

44

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Следует отметить существенную особенность, связанную со вкладами продольной (аксиальной Еaks) и поперечной (Еrad) составляющих электрического поля. Типичными значениями напряженности управляющего (продольного) электрического поля при электрокинетическом управлении являются 20-50 кВ/м, в отдельных случаях до 75 кВ/м. Вместе с тем, на отдельных стадиях анализа напряженность продольного электрического поля не превосходит 200В/см. То есть, характерным масштабом напряженности электрического поля является 104 В/м. Вклад поперечного электрического поля можно оценить косвенно, основываясь на уравнении ПуассонаБольцмана. Поскольку потенциал на оси микроканала может быть достаточно близок к нулю, а на стенке он равен дзета-потенциалу, то приближенной оценкой

напряженности электрического поля можно считать Erad ≈ ζ / r , где r – радиус (или

полуширина) канала. Величина дзета-потенциала имеет порядок 10-100 мВ (10-2-10-1

В), типичная полуширина микроканала – 10-5-10-4 м (10-100 мкм). Следовательно, Erad =102-104 В/м, и эта составляющая может быть соизмерима с продольной. При этом,

методы управления составляющими электрического поля принципиально разные. Продольное поле регулируется выбором управляющих потенциалов; для

поперечного поля требуется управление (модификация) поверхности канала с подбором величины дзета-потенциала. Кроме того, поперечное распределение потенциала еще зависит от температуры.

4.Управление движением и разделение частиц в жидкости. Особенности воздействия внешних полей на биологические частицы (макромолекулы,

клетки).

При разделении и анализе микрочастиц (молекул, ионов) используются разновидности методов микрохроматографии, фильтрации, электрофореза. Что касается разделения макромолекул или крупных биологических частиц (ДНК, белков), то здесь возможно применение только ограниченного количества способов, например, импульсный электрофорез и седиментационные методы. При комплексных исследованиях обычно большие молекулы пытаются «расчленить» на фрагменты и исследовать каждый фрагмент отдельно. Такой подход, конечно, является продуктивным, но при этом важная часть информации утрачивается. Часто оказывается необходимым изучить микрочастицу как индивидуальную частицу, чтобы выявить ее специфические функции, корректно и полно определить ее свойства и характеристики. Наиболее сложными объектами для исследования являются живые клетки. Анализ содержания и поведения отдельных клеток важен для фундаментального понимания их функций в окружающей среде: сложных процессов взаимодействия клеток, химического повреждения, ответа на внешние воздействия. Клетки содержат большое разнообразие компонентов от маленьких молекул до белков. Многие из этих компонентов присутствуют в мельчайших количествах и чрезвычайно маленьких объемах. Таким образом, аналитические инструменты для изучения клеток должны позволять проводить анализ не только малых объемов образцов, но и следовых уровней разнообразных аналитов. В технике микрофильтрации используются различия в размерах микрочастиц, а их движение обеспечивается гидродинамическим давлением. С помощью микро- и нанотехнологий можно создать в органических и неорганических материалах разнообразные конструкции фильтров, например, множество постов, извилистых или ступенчатых каналов с целью эффективного разделения одних частиц от других. Преимущество микрофильтрации состоит в том, что этот процесс не требует создания специальных буферных условий разделения. Но

45

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

необходимо, чтобы существовало различие в размерах между разделяемыми типами частиц.

Для изучения клеток традиционно используются электрокинетические методы. Наличие особых свойств клетки (например, двойной электрический слой, окружающий клетку) приводит к тому, что электрокинетическое движение клеток происходит по несколько иным принципам, чем в случае высокомолекулярных микрочастиц (ДНК, белки). Электрофорез не позволяет воспроизводимо разделить клетки по каким-либо характеристикам, кроме разности их подвижностей. Поэтому, при разделение клеток обычно применяют разные варианты диэлектрофореза (ДЭ) (Dielectrophoresis - DEP).

В основе диэлектрофореза лежит явление взаимодействия частиц с неоднородным электрическим полем в среде, что является активным подходом к разделению. В переменном электрическом поле клетки проявляют разные диэлектрические свойства в зависимости от характеристик этого поля, а именно, частоты, фазы, амплитуды. Поэтому, выбирая соответствующие характеристики поля для образца можно разделить различные типы клеток и сосредоточить их в различных областях микроэлектродов в зависимости от их индивидуальных диэлектрических откликов на прикладываемое электрическое поле. Из-за простоты ДЭ широко используется в микрочиповых приборах для разделений бактерий, раковых клеток, стволовых клеток, субпопуляций лейкоцитов. В отличие от микрофильтрации, диэлектрическое разделение не ограничено различиями в размерах между клетками или частицами. В принципе, различные типы клеток могут быть отделены с одной и той же конструкцией электрода при подборе соответствующей частоты для каждого типа клетки. Таким образом, преимуществом ДЭ является гибкость, полная контролируемость, удобство для автоматизации. Но реализация диэлектрических разделений требует подбора сепарационного буфера с низкой проводимостью, а это означает, что клетки не могут быть непосредственно отделены в исходном образце.

В настоящее время существуют и развиваются следующие эффективные способы управлением движением и разделением частиц в жидкой среде: а) с помощью силовых полей (давление, разряжение, гравитация, центробежные силы); б) электрических полей (постоянные – электроосмос, электрофорез и переменные – диэлектрофорез, электроротация и т.д.); в) магнитных полей (магнитофорез); г) электромагнитных полей (фотофорез, оптофорез, электромагнитофорез); д) лазерного излучения (оптический пинцет); е) ультразвуковых полей (сонофорез) и т.д.

5.1. Диэлектрофорез (Dielectrophoresis).

Диэлектрофорез - перемещение микрочастицы в неоднородном электрическом поле, вызванное взаимодействием между вынужденным (индуцируемым) диполем в микрочастице и внешним электрическим полем. При воздействии электрического поля на поляризуемую частицу в частице индуцируется дипольный момент. Если электрическое поле изменяется, то на частицу действует сила, которая может перемещать ее к области с высокой или низкой напряженности поля в зависимости от поляризационных способностей частицы по сравнению с окружающей средой. Если поляризуемость частицы выше, чем среды, то сила направлена к области с высокой напряженностью поля (положительный ДЭ). В противном случае - к области с более низкой напряженностью (отрицательный ДЭ).

5.1.1. Основные принципы диэлектрофореза.

46

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Если рассматривать микрочастицу (в частности, биологический объект - клетку, сложные молекулы, ДНК) как конгломерат молекул, представленных в виде диполей, то на каждую молекулу, помещенную в электрическое поле с напряженностью Е, действует сила F. Суммарная сила, приводящая к движению микрочастицы складывается из отдельных электрокинетических сил. Кроме этого для подобных микрочастиц характерны особые свойства, например двойной электрический слой, который окружает микрочастицу и смещается во внешнем электрическом поле.

Суммарная электрическая сила, действующая на частицу с распределенным зарядом q в неоднородном электрическом поле E может быть определена:

F= qE + (mr )E , где - векторный набла-оператор, m - дипольный момент частицы.

Вслучаях, когда частица не имеет заряда или при частотах поля выше 1кГц (когда электрофоретические эффекты незначительны) второе слагаемое уравнения (содержащее дипольный момент и градиент электрического поля) преобладает и поэтому усредненную по времени силу можно выразить как:

F(ω)= Re m(ω) E2 / 2E , где ω - частота колебаний поля.r r r

Можно показать, что диэлектрофоретическая сила, действующая на сферическую частицу, определяется:

FDEP = 2πVεmαr (E2RMS ), где V – объем частицы, ERMS - средняя величина напряженности электрического поля (в предположение синусоидальной зависимости от времени), ar - реальная часть фактора Клаузиуса-Мосотти (Clausius-Mosotti), который связан с диэлектрическими постоянными частицы εp и среды εm.

Здесь (*) обозначает, что диэлектрические постоянные – комплексные величины. Для гомогенных частиц и среды комплексная диэлектрическая постоянная:

ε*p,m =ε p,m + σjpω,m . Эта зависимость от частоты поля важна при моделировании

движения биологических клеток, так как клетки – сложные объекты, состоящие из разных компонентов и структур. Разные же материалы имеют различные электрические свойства, что приводит к разнообразным поляризационным эффектам, в том числе и поляризации на границах клеточных структур.

Диэлектрофоретическая сила зависит от размера частицы, от величины и степени неоднородности приложенного электрического поля (градиент амплитуды или фазы). Полярность этой силы зависит от полярности вынужденного диполя, которая в свою очередь определяется проводимостью и поляризацией микрочастицы и окружающей ее среды. Эта сила вызывает движение частицы в направлении градиента поля или против него, в зависимости, является ли частица более полярной, чем среда в которой она находится (рис. 5.1.1). Диэлектрофоретическая сила возникает только в случае неоднородных полей. В остальных случаях сила равна нулю.

Движение частицы является результатом баланса приложенной ДЭ силы, вязкого трения, гравитационных сил, сил инерции, поверхностного трения/прилипания и притяжения между частицами, а также последующего влияния конвекции жидкости изза давления, электротермического или электроосмотического потоков.

47

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

В случае низких чисел Рейнольдса (Re<10-5) инерционностью потока можно пренебречь. Часто предполагается отсутствие конвекции и малость поверхностных сил. Таким образом, баланс между силой ДЭ и вязкой силой определяет кинетику нейтрально плавающих частиц радиуса R:

масштабирующий фактор, равный единице для твердых частиц, движущихся, вдали от стенки, но увеличивающийся около стенки (отражающий влияние вязких сил), d – расстояние между электродами.

Скоростной профиль частиц может быть определен по формуле:

В отличие от электрокинетического потока, диэлектрофоретическое движение – вдоль градиента электрического поля, может концентрировать и разрежать частицы. Диэлектрофоретическая скорость пропорциональна градиенту электрического поля.

Для растворов поток частиц j в изолированных каналах, включая диффузию, электрокинетический поток и диэлектрофорез: j = −D c + c[u + uEK + uDEP ], где

D – коэффициент диффузии, с – концентрация частиц, u – неэлектрокинетическая компонента скорости.

Поскольку размер частицы мал, то значительное влияние оказывают эффекты Броуновского движения. Чтобы диэлектрофоретическая сила была эффективной, она должна преодолеть Броуновское движение. Поэтому, для диэлектрофоретической манипуляции с частицами микро- и наноразмеров, необходимо уменьшать характерные размеры системы управления (электродов управления) и увеличивать электрическое поле. Однако, высокая величина электрического поля приводит к нагреву буфера, может вызывать электрохимические процессы на электродах.

Наиболее простым способом создания неоднородного электрического поля является применение электродов различной формы. Современные методы микро- и нанотехнологий позволяют получить любую геометрию электродов требуемых размеров. Самыми распространенными конструкциями являются сочетание пластинчатых и игольчатых электродов. Вблизи пластинчатого электрода формируется электрическое поле с меньшей напряженностью, в то время как у игольчатого - формируется поле с большей напряженностью (рис. 5.1.1).

К настоящему времени разработаны стратегии разделения частиц, которые могут быть реализованы в микрочиповых системах: разделение частиц в потоке;

48

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

диэлектрофоретическое фракционирование в поле потока (DEP-FFF: DEP-Field Flow Fractional); пошаговое разделение в потоке (stepped flow separation), диэлектрофорез

«бегущей волны» (traveling wave dielectrophoresis) и другие.

Простейшая реализация первого способа разделения – использование площадки с множеством электродов, через которую проходит поток жидкости со смесью частиц. Два вида частиц (светлые и темные) движутся поперек множества электродов (рис. 5.1.2). Темные частицы тормозятся положительным диэлектрофорезом, в то время как легкие частицы проходят через площадку. Затем электрическое поле снимается, и темные частицы потоком вымываются и могут быть отдельно собраны.

При диэлектрофоретическом фракционировании в поле потока используют отрицательный диэлектрофорез, как источник силы, обеспечивающий нахождение частицы на некотором расстояние от поверхности электродов. При этом на частицу действуют сила тяжести, гидродинамическая и диэлектрофоретическая силы, что позволяет распределить частицы в соответствии с их свойствами послойно над поверхностью электродов. Иногда этот принцип называется принципом гиперслойного разделения. Подобные устройства использовались для демонстрации фракционирования латексных шариков, бактерий и раковых клеток.

Рисунок 5.1.1. Частица в неоднородном электрическом поле. Частица подвергается действию неоднородного электрического поля и движется силой, обусловленной а)

градиентом амплитуды поля, б) градиентом фазы поля.

49

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Рисунок 5.1.2. Разделение частиц в потоке.

Пошаговое разделение в потоке осуществляется с помощью специальных диэлектофоретических шаговых сепараторов – конструкций электродов в виде гребенки (рис. 5.1.3). Частицы с большей проводимостью сосредоточиваются в областях с высокой напряженностью поля (положительный ДЭ), образуя скопления в виде бус. Частицы с меньшей проводимостью скапливаются в областях с низкой напряженностью поля, образуя при этом характерные дельтовидные скопления. Чередование циклов подачи и снятия напряжения с потоками, вымывающими частицы, позволяет проводить эффективное разделение частиц.

При разделении частиц способом ДЭ «бегущей волны» применяется изменение градиента фазы электрического поля, обеспечиваемое конструкцией подводящих электродов, выполненных в виде спиральных электродных площадок (рис. 5.1.4).

Рисунок 5.1.3. Разделение частиц с использованием гребенчатых электродов.

Электроды сформированы так, что создают четыре соединенных в спираль электрода, на которые подаются электрические сигналы со сдвигом фаз. Это дает возможность получить управляемое электрическое поле. Частицы внутри такой конструкции испытывают силу, продвигающую их или к центру спирали или от центра.

50