7

3. Общие свойства ферментов

3.1.Специфичность действия ферментов

Ферменты обладают высокой специфичностью действия. Специфичность действия фермента предопределяется строгим соответствием пространственной конфигурации субстрата и активного центра фермента.

Формирование активного центра фермента начинается уже на ранних этапах синтеза белка – на рибосоме, когда линейная одномерная структура пептидной цепи превращается в трехмерное тело строго определенной конфигурации.

Основной движущей силой в возникновении трехмерной структуры является взаимодействие радикалов аминокислот в водной среде при определенных значениях ионной силы, рН раствора и температуры и т.д. При этом неполярные гидрофобные радикалы аминокислот как бы погружаются внутрь белковой молекулы, образуя там сухие зоны, в то время как полярные радикалы оказываются ориентированными в сторону воды. В какой–то момент возникает термодинамически наиболее выгодная стабильная биологически активная конформация молекулы белка.

При уникальном сочетании нескольких аминокислотных остатков, расположенных в разных точках полипептидной цепи формируется каталитический центр фермента. Чаще всего в каталитических центрах однокомпонентных ферментов встречаются остатки сер, гис, три, арг, цис, асп, глу и тир, содержащие в радикале группы – ОН, –СООН,–NН2, –НS.

Так как каталитический центр однокомпонентного фермента возникает в тот момент, когда молекула приобретает присущую ей третичную структуру, то третичной структуры фермента под влиянием тех или иных факторов может привести к деформации каталитического центра и изменению ферментативной активности. У двухкомпонентных ферментов в состав каталитического центра еще входят группа небелковой природы. Добавочную группу, прочно связанную с белком называют простетической группой; легко отделяемую от белка и способную к самостоятельному существованию – коферментом.

В активном центре условно различают каталитический центр, непосредственно вступающий в химическое взаимодействие с субстратом и связывающий центр, обеспечивающий специфическое сродство к субстрату и формировании его комплекса с ферментом. В свою очередь молекула субстрата также содержит функционально различные участки: одну специфическую связь (или группу атомов), подвергающуюся атаке со стороны фермента, и один или несколько участков, избирательно связываемых ферментом.

Пространственное соответствие структуры субстрата и активного центра фермента создается в момент их взаимодействия друг с другом, что может быть выражено формулой «перчатка–рука». При этом в субстрате уже деформируются некоторые валентные связи и он, таким образом, подготавливается к дальнейшему каталитическому видоизменению, а в молекуле фермента происходят конформационные пере-

9

Свойство специфичности можно установить на примере действия ферментов a– амилазы – (1,4–a–глюкан–4–глюканогидролаза) и сахаразы (a–D – глюкопиранозил– (1®2) –b–D – фруктофуранозид).

a–Амилаза катализирует гидролиз 1,4–гликозидных связей в молекуле крахмала и гликогена без какого–либо определенного порядка с образованием небольшого количества олигосахаридов, декстринов и мальтозы. В зависи-мости от состава и свойств декстрины делятся на:

¾амилодекстрины, окрашивающиеся раствором йода в фиолетово-синий цвет;

¾эритродекстрины, окрашивающиеся йодом в красно–бурый цвет;

¾ахродекстрины, окрашиваются в желтый цвет;

¾мальтодекстрины, не окрашивающиеся йодом;

Сахараза расщепляет сахарозу на a–D–глюкозу и b–D фруктозу.

Принцип метода. Действие a–амилазы на крахмал обнаруживают по реакции с йодом: нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, а расщепленный окрашивается в цвет в зависимости от глубины гидролиза: от сине–фиолетового до желтого.

Действие сахаразы на сахарозу можно установить по реакции Троммера. Сахароза не содержит свободный полуацетальный гидроксил альдегидной группы, поэтому не дает реакции Троммера. Реакция Троммера может быть положительной, толь-

ко в том случае, если сахароза расщепляется на свои составные части a–D– глюкозу и b–D–фруктозу под действием фермента сахаразы.

(сахароза)

Реакция Троммера заключается на способности свободной альдегидной или кетонной группы молекулы сахара (глюкозы и фруктозы) взаимодействовать со щелочным раствором окисной меди (II) и восстанавливать ее до оксида меди (I), выпадающего в виде осадка красного цвета.

СuSO4 + 2 NаОН ¾¾® Сu (OH)2 + Nа2SO4

10

Ход работы. Приготовление растворов ферментов.

5 г хлебопекарных дрожжей растирают в ступке с битым стеклом, прибавляют понемногу 10 мл дистиллированной воды и оставляют стоять на 30 мин. при 37 °С при периодическом помешивании, затем фильтруют. Фильтрат является источником сахаразы.

Берут 4 пробирки, нумеруют. В первые две наливают по 1 мл 0,1 % –го раствора крахмала, в две другие – по 2 мл 1 %-го раствора сахарозы. В первую и четвертую добавляют по 1 мл раствора амилазы (слюна, разведенная в 10 раз), во вторую и третью – 1 мл сахаразы. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и выдерживают

в термостате при 37–40 °С 10 минут. Затем пробирки охлаждают водопроводной водой. В пробирки с крахмалом вносят несколько капель раствора Люголя; в пробирках с сахарозой проводят реакцию Троммера, для чего добавляют равный объем 10 % раствора едкого натра. Затем по каплям добавляют 5 % раствор сернокислой меди до появления неисчезающей мути гидроокиси меди. Осторожно нагревают содержимое пробирок. Появление красного осадка (оксида меди (I)) указывает на положительную реакцию Троммера.

3.2.Влияние температуры и рН на активность ферментов

Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях: температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом, скорость катализируемой реакции прямо пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции.

Механизм биохимической ферментативной реакции можно представить упрощенно в общем виде:

где Е – фермент; S – субстрат;

ES – фермент-субстратный комплекс; Р – продукт реакции;

k+1, k–1, k2 – константы скоростей прямых и обратных реакций.

Константа Михаэлиса – Ментен (Кm) характеризует константу диссоциации фермент–субстратного комплекса и численно равна концентрации субстрата (в

11

моль/л), при которой скорость данной реакции составляет 1/2 от максимальной. Она характерна для каждой пары фермент–субстратного комплекса.

Уравнение Михаэлиса – Ментен выражает зависимость скорости биохимиче-

ской

ферментативной реакции от концентрации субстрата:

где V – скорость данной биохимической реакции; Vmax– максимальная скорость реакции;

[S] – концентрация субстрата;

Кm – константа Михаэлиса – Ментен.

Если концентрация субстрата в реакции низка, т.е. [S]<<Кm, то уравнение приобретает вид:

т.е. при низких концентрациях субстрата скорость биохимической реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата и описывается уравнением I-го порядка.

При высоких концентрациях субстрата, т.е. [S] >> Кm, величиной К можно пренебречь, тогда

Таким образом, при высоких концентрациях субстрата скорость биохимической реакции становится максимальной и описывается уравнением нулевого порядка (рисунок 1).

V

n = 0

n = 1

[S] участок кривой при n = 0 – уравнение реакции 0-го порядка; участок кривой при n = 1 – уравнение реакции 1-го порядка.

Рисунок 2 – График зависимости скорости биохимической реакции (V) от концентрации субстрата [S]

Любые воздействия, приводящие к денатурации, т.е. нарушению третичной структуры, приводят к искажению или разрушению структуры активного центра и соответственно потере ферментом каталитических свойств.