где: Ер – протеолитическая активность ферментного препарата; С – концентрация ферментного препарата, мг;

А – количество растворимых продуктов гидролиза казеина за определенный промежуток времени, мг

где: В – количество продуктов гидролиза казеина в соответствующе измеренной экстинкции;

7,5 – объем пробы (2 мл субстрата, 0,5 мл ферментного препарата, 5 мл раствора ТХУ);

V – количество раствора, взятого для колориметрирования, мл.

Материалы и реактивы. Казеин (см. Приложение 1, п.7); реактив А, В, С (см. Приложение 1, п.17); реактив Фолина (см. Приложение 1, п. 8); ферментные препараты; 1,125 М раствор ТХУ; 0,75 М раствор едкого натра.

Оборудование. Складчатый фильтр; пробирки; пипетки на 1 и 2 мл с ценой деления 0,05 мл; ФЭК–60 или ФЭК–56М.

4.3.Эстеразы

Липаза или триацилглицероллипаза катализирует расщепление жиров (триацилглицеринов) на глицерин и жирные кислоты. Реакция идет по схеме:

По существующей классификации ферментов липаза принадлежит к классу гидролаз и подклассу эстераз, действующих на сложноэфирные связи.

Как и в случае других гидролаз, радикал гис активного центра фермента служит для переноса протонов, радикал сер – для акцептирования ацильной группы, высвобождающейся в момент распада сложноэфирной связи в молекуле триглицерида. Радикал изолейцина взаимодействуют с углеводородным радикалом остатка высшей жирной кислоты и способствует закреплению молекулы триглицерида в активном центре фермента (см. рисунок 7).

42

Источником для получения промышленных препаратов липазы являются поджелудочная железа, семена клещевины.

Активаторами липазы служат соли желчных кислот. Активирующий эффект основан на эмульгирующем действии.

рН–оптимум активности (и стабильности) у разных ферментных препаратов различен и зависит от источника фермента. Так, панкреатическая липаза имеет оптимум активности при рН = 8, липаза молока – при рН = 9, липаза из клещевины – при рН = 4,3, микробные липазы – при рН = 5–6. Из перечисленных липаз наиболее термостабильной является липаза молока.

Липазам принадлежит важная роль в технологии продуктов питания. В молоке слабая липазная активность способствует образованию аромати-зирующих веществ; липаза пшеницы и других злаковых культур способствуют порче муки. Наконец, микробные препараты липазы используются для гидролиза жира в тех случаях, когда необходимо омыление при сохранении биологически активных жирорастворимых веществ (например, токоферола).

4.3.1. Гидролитическое расщепление жира под действием липазы

Принцип метода. Гидролиз жира хорошо наблюдается под влиянием липазы поджелудочной железы. Удобным субстратом является молоко, жир которого находится в эмульгированном состоянии. Активаторами липазы является желчь. Степень гидролиза жира можно определить по изменению рН за счет образования свободных жирных кислот и количеству этих кислот, определяемых титрованием раствором щелочи отдельных проб молока.

Ход работы. В 3 пробирки налить по 2–3 мл молока, предварительно прокипяченного и охлажденного. В каждую из них добавляют по одной капле фенолфталеина и по 1 –2 капли 10 %–ного раствора соды до розового окрашивания. В первую пробирку приливают 5 капель желчи, которая является активатором липазы. В 1–ю 2–ю пробирку приливают 2 капли 5 %–ного раствора панкреатина (источник липазы), в 3–ю – того же панкреатина, но предварительно прокипяченного. Все пробирки ста-

вят в термостат при 37 °С и наблюдают:

¾В какой пробирке окраска не изменилась? Почему?

¾В каких пробирках окраска изменилась? Почему?

¾В какой пробирке окраска изменилась быстрее и почему?

Делают выводы о действии желчи на действие липазы.

Материалы и реактивы. Молоко цельное и охлажденное; препарат липазы, панкреатин; 1 %–ный спиртовой раствор фенолфталеина;10 %–ный раствор соды.

Оборудование. Термостат; пробирки; пипетки на 1 мл.

4.3.2. Определение активности липазы

В растениях липазы широко распространены. Особенно их много в семенах масличных культур. У каждого вида растений есть свои липазы, проявляющие свою

43

активность при различных значениях рН, потому иногда различают кислую, нейтральную и щелочную липазы, которые проявляют свою максимальную активность соответственно в кислой, нейтральной или щелочной среде. В семенах масличных культур содержатся в основном кислые и щелочные липазы.

Принцип метода. Основан на определении количества жирных кислот, образующихся при действии липаз на растительный жир. В качестве источника липаз используют семена масличных культур. Титрование образовавшихся кислот щелочью происходит по схеме:

RСООН + NаОН ¾¾¾® RСООNа + Н2О

Активность липаз определяют в слабокислой или щелочной среде.

Ход работы. 2–3 г масличных культур растирают в ступке, в растертую массу добавляют 50 мл кислого или щелочного буфера и смесь тщательно перемешивают. Кислый ацетатный буфер (рН = 4,7) готовят смешиванием разных объемов растворов 1 н. уксусной кислоты и 1 н. уксусного натрия или уксусного аммония и 2 объемов воды. Для приготовления щелочного боратного буфера (рН = 8,5) растворяют в воде 12,404 г борной кислоты, прибавляют 100 мл 1 н NаОН и доводят общий объем раствора до 1 л. Из этого раствора берут 650 мл, прибавляют к нему 350 мл, 0,1 н раствора НСl и тщательно перемешивают. Полученные смеси переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10–15 мин 5 тыс. об/мин. Для определения ферментативной активности из каждой пробирки берут 2 пробы по 20 мл и переносят их в конические колбы на 100 мл с притертыми пробками. Содержимое одной из колб кипятят 3 минуты для инактивации ферментов. Затем в колбы вносят по 1 мл чистого подсолнечного масла, которое служит субстратом для действия липаз, до-

бавляют по 5 капель толуола, перемешивают и ставят в термостат при 30 °С на 20–24 ч.

После инкубации в термостате во все колбы приливают по 50 мл смеси этилового спирта с эфиром (4:1) и взбалтывают. После отстаивания титруют 0,1 н спиртовым раствором NаОН в присутствии нескольких капель тимолфталеина.

Вычисление результатов. Активность кислых и щелочных липаз выражают в миллилитрах 0,1 н. NаОН, пошедшей на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся в результате действия липаз на 1 г семян. Расчеты проводят по формуле:

где Еа – активность липазы, мл/г;

V1 – количество 0,1 н. NаОН, израсходованное для титрования опытного образца, мл;

V2 – количество 0,1 н NаОН, израсходованное для титрования контрольного (предварительно прокипяченного) образца, мл;

Т– поправка к титру 0,1 н. NаОН;

44

m – навеска семян, соответствующая объему вытяжки (20 мл), взятому для определения ферментативной активности, г.

Материалы и реактивы. Ацетатный буфер рН 4,7 (см. Приложение 1, п.10); 0,2 М боратный буфер рН 8,5; 0,1 н. NаОН; этиловый спирт; эфир; подсолнечное масло; толуол; 1 %–ный спиртовой раствор тимолфталеина.

Оборудование. Автоматическая мешалка; термостат; ступки фарфоровые; конические колбы на 100 мл с притертыми пробками; пипетки.

45

Приложение 1

1.В нескольких мл воды растворяют 1 г йодистого калия, затем растворяют 1

гйода и доливают водой до 300 мл; 3 г йодистого калия растворяют в 70 мл воды в мерной колбе емкостью 100 мл добавляют 0,3 г. растертого в ступке йода и после растворения йода доводят водой до метки. Раствор хранят в темной склянке.

2.Фосфатный буфер, 0,1 М раствор, рН = 5,6. Состоит из двух растворов:

а) 0,1 М раствор двухзамещенного фосфорнокислого натрия (17,8 г Na2НРО4 ×2Н2О или 35,82 Na2НРО4 × 12 Н2О в 1 л);

б) 0,1 М раствор однозамещенного фосфорнокислого натрия (18,8 г NaН2РО4 × Н2О или 31,21 г NaН2РО4 .2Н2О в 1 л). При смешивании 4,0 мл раствора "а" и 96 мл раствора "б" получают буферную смесь м рН 5,6.

3.Фелинг II. 200 г сегенетовой соли растворяют в 500 мл воды, 150 г гидроксида натрия растворяют в 300 мл воды, затем раствор щелочи осторожно приливают

краствору соли и объем доводят водой до 1 л.

4.Железоаммиачные квасцы, раствор. 86 г железоаммиачных квасцов растворяют в 500 мл воды и осторожно по стенкам приливают 200 г (108 мл) концентрированной серной кислоты, объем доводят водой до 1 л.

5.(9,077 г/л КН2РО4 и 23,283 г/л Nа2РО4×12Н2О); для приготовления буфера смешивают 5,5 мл первого раствора и 94,5 мл второго раствора.

6.Приготовление 0,1 %–ного раствора казеина. 3,8 г Nа3РО4 ×12Н2О растворя-

ют в 80 мл дистиллированной воды при 40 °С, добавляют 100 мг казеина и после полного растворения последнего устанавливают рН смеси 1 н. НСI на уровне 6.5; объем раствора доводят дистиллированной водой.

7. Реактив Фолина. В круглодонную колбу на 1,5–2,0 л вносят 100 г вольфрамовокислого натрия–гидрата (NaWО4 .2Н2О), 25 г молибденовокислого натрия–гид-

рата (NaМоО4 ×2Н2О), 750 мл дистиллированной воды, 50 мл 85% фосфорной кислоты Н3РО4 и 100 мл концентрированной соляной кислоты, после чего смесь нагревают при умеренном кипячении с обратным холодильником. После кипячения прибавляют 150 г сернокислого лития 50 мл дистиллированоой воды, 5 капель бромной воды. Избыток удаляют кипячением под тягой без холодильника в течении 30 минут,после чего жидкость охлаждают и разводят дистиллированной водой до 1 литра. Хранят в темной склянке. Перед употреблением реактив разводят водой в отношении: реактива: 3 части дистиллированной воды.???

8.1 г казеина растворяют при нагревании на водяной бане в 10 мл 10 %–ной НСI и прибавляют воды до объема 1000 мл;

9.Ацетатный буфер, 0,3 М раствор, рН 4,7. Состоит из двух растворов в соотношении 1:1:

а) 0,3 М раствор уксусной кислоты; б) 0,3 М раствор уксуснокислого натрия.

47

17.Раствор ферментов: 250 мкг глюкозооксидазы из плесневого гриба и 41,7 мкг пероксидазы из корней хрена растворяют в 10 мл 0,1 М Nа–фосфатного буфера, рН 7,0.

18.1 %– ный раствор казеина рН 8,0: 1 г казеина заливают 100 мл 1/5 М фосфатного буфера рН 8,0 и нагревают на водяной бане до полного растворения. Проверяют рН раствора и доводят его точно до 8,0. Раствор казеина можно хранить в холодильнике не более трех суток.

19.1 %–ный раствор гемоглобина рН 3,0 готовят растиранием в ступке 1,0 г гемоглобина с небольшим количеством воды. Содержимое ступки переносят в мерную колбу на 100 мл, подкисляют 0,3 н. НСl до рН 3,0 и доводят водой до метки. Полученный раствор неустойчив, его следует готовить ежедневно.

Для приготовления растворов гемоглобина с рН 6,0 и 8,0 растворяют в 100 мл 1/15 М фосфатного буфера с соответствующим значением рН 1,1 г гемоглобина, затем в раствор добавляют 36 г мочевины и оставляют при комнатной температуре. После этого растворы доводят до нужного значения рН 1 н. NаОН или 1 н. НСl

48

Приложение 2

Таблица 5 – Международная классификацияH3C O ферментовпируватдекарбоксилаза