30

Рисунок 6 – Упрощенная схема гидролиза пептидной связи в активном центре химотрипсина

тир, три, лей), благодаря контакту радикала фен (или тир, три, лей) с субстратным центром, фермента, который на рисунке не показан. Вследствие того, что электронная пара кислорода гидроксильной группы радикала сер акцептируется карбонильной группой пептидной связи, создаются условия для миграции протона от гидроксила сер к имидазольному радикалу остатка гис для ацилирования радикала сер с одновременным разрывом пептидной связи. Одновременно протон от имидазольного ядра радикала гис перемещается к NН – групп деструктируемой пептидной связи (I). После ацилирования радикала сер (II) в активный центр фермента входит молекула воды, инициирующая распад ацильного производного фермента (III) и восстановлении исходного состояния активного центра (IV), готового принять новую молекулу субстрата или атаковать пептидную связь, образованную остатками фен, тир, три или лей в том же субстрате.

Ферментативный гидролиз белков находит практическое использование при определении первичной структуры белков, для регуляции обмена веществ, т.к. многие продукты селективного гидролиза белков обладают высочайшей биологической активностью: именно этим путем из проферментов образуются ферменты, из предшественников гормонов – гормоны и рилизинг – факторы.

Важным этапом технологии многих пищевых производств являются биохимические превращения белков, происходящие под действием протеолитических ферментов. Повышенная активность протеаз наблюдается в прорастающем зерне пшеницы, ржи, что приводит к снижению хлебопекарных достоинств муки из такого зерна. На пивоваренных заводах ячмень проращивают с целью накопления ферментов, в том числе и протеолитических, для осуществления гидролиза белковых веществ при приготовлении пивного сусла.

Протеолитические ферменты входят в состав ферментных препаратов грибного и растительного происхождения, широко применяемы для интенсификации технологических процессов производства различных пищевых продуктов и улучшения их качества.

4.2.1. Гидролитическое расщепление казеина под действием пепсина.

Принцип метода. При гидролитическом воздействии пепсина на казеин часть молекул его расщепляются, а часть не успевает подвергнуться воздействию фермента. Непрогидролизованный казеин может быть осажден из кислого раствора уксуснокислым натрием, а продукты распада белка остаются при этом в растворе.

Ход работы. Берут одиннадцать чистых и сухих пробирок. В первую пробирку наливают 0,1 %–ный раствор пепсина, а в остальные по 1 мл 0,2 %–ного раствора соляной кислоты.

Во 2–ю пробирку добавляют 1 мл 0,1 %–ного раствора пепсина перемешивают и 1 мл смеси переносят в 3–ю пробирку, перемешивают и 1 мл смеси переносят в 4–

31

ю пробирку, в 5–ю и т. д. до десятой пробирки. Получается 1–я пробирка исходная, а в остальных разбавления в 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 и т. д. раз. Последняя пробирка является контрольной.

Во все пробирки добавляют по 10 мл 0,1 %–ного кислого раствора казеина и помещают в термостат при 38 °С на 20 минут. Затем во все пробирки наливают по несколько капель 25 %–ного раствора уксуснокислого натрия. При этом нерасщепленный казеин будет осаждаться (происходит помутнение).

Если помутнение произошло во всех пробирках, начиная с 7–й, то в 6–й пробирке (разбавление в 32 раза) казеин нацело расщепился. Значит, 1 мл неразведенного раствора мог бы расщепить 320 мл 0,1 %–ного раствора казеина.

Материалы и реактивы. 0,1 %–ный раствор пепсина в 0,2 %–ной соляной кислоте; раствор казеина (см. Приложение 1, п. 9); 0,2 %–ная соляная кислота; 25 %– ный раствор уксуснокислого натрия.

Оборудование. Термостат; пипетки на 1 мл; штатив с пробирками.

4.2.2. Определение активности протеаз по методу Ансона

Принцип метода. Заключается в определении количества аминокислоты тирозин, образующейся при гидролизе ферментным препаратом стандартного белка (казеина, казеината натрия или гемоглобина).

Непрореагировавший белок осаждают, а белок, подвергшийся гидролизу пропорционально содержанию тирозина, определяют колориметрически реакцией Фолина. Полученные величины оптической плотности подставляют в формулу и рассчитывают протеолитическую активность ферментного препарата.

Протеолитическая активность характеризует способность ферментов катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот и выражается числом единиц протеазы в 1 г очищенного препарата.

За единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 30 °С превращает в неосажденные трихлоруксусной кислотой продукты гидролиза казеината натрия в количестве, соответствующем 1 мкмоль тирозина (1 мкмоль тирозина составляет 0,181 мг).

Данный метод позволяет определить активность протеаз грибного и бактериального происхождения при рН среды: кислые 2,5 и 5,5, нейтральные 7,2 и щелочные 9,5.

Ход работы. Построение градуировочной кривой.

В1 л 0,2 н раствора соляной кислоты растворяют 181,2 мг тирозина (основной раствор). Из основного раствора готовят разбавленные. Для этого в мерную колбу на 50 мл раствор вносят в количествах указанных в таблице 4. Объем в колбах доводят до метки 0,2 н раствором соляной кислоты.

В7 пробирок вносят по 1 мл раствора тирозина разной концентрации, добавляют в них по 5 мл 0,5 М карбоната натрия и 1 мл раствора Фолина. В контрольном опыте вместо раствора тирозина берут 1 мл дистиллированной воды. Через 20 минут растворы колориметрируют при 656–670 нм и строят градуировочную кривую.

32

Таблица 4 – Результаты определения оптической плотности

Для этого на оси абсцисс откладывают количество тирозина С (в мкмоль/мл), на оси ординат – соответствующее значение оптической плотности Д. Тирозиновый эквивалент (ТЭ) определяют из соотношения:

где D – оптическая плотность;

С– содержание тирозина в 1 мл раствора, мкмоль.

Приготовление ферментного раствора. 0,1–1,0 г исследуемого препарата растирают стеклянной палочкой в стаканчике на 50 мл с небольшим количеством буферного раствора с рН 5,5. Затем содержимое стаканчика количественно переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят этим же буферным раствором до метки.

Из полученного раствора путем разведения готовят рабочий раствор до необходимой концентрации фермента. Разведение должно быть подобрано так, чтобы в реакционной среде был избыток субстрата, а измеряемые оптические плотности при колориметрировании в кювете с рабочей гранью 10 мм находились в пределах от 0,1 до 0,75.

Определение активности протеаз. В пробирку на 20 мл наливают 2 мл 2 %– ного раствора казеината натрия, помещают ее в термостат при 30 °С и через 5–10 минут добавляют 2 мл ферментной вытяжки, перемешивают и выдерживают при 30°С 30 минут. Казеинат при этом частично гидролизуется. Для инактивации действия ферментов в пробирку прибавляют 4 мл 0,3 М–ной трихлоруксусной кислоты, встряхивают и оставляют пробирку еще на 20 минут при 30°С. После этого содержимое пробирки фильтруют или центрифугируют. В сухую пробирку вносят 1 мл фильтрата, 5мл 0,5 М раствора карбоната натрия, перемешивают, приливают 1 мл реактива Фолина. Через 20 минут определяют оптическую плотность раствора на фото-

33

электро-колориметре при 670 нм в кювете толщиной 10 мм в сравнении с контрольной пробой. Для получения контрольной пробы 2 мл разведенного ферментного раствора приливают к 4 мл 0,3 М раствора ТХУ, выдерживают в термостате при 30

°С 10 мин, а затем к раствору добавляют 2 мл субстрата. После перемешивания пробирку выдерживают 20 минут при 30 °С, фильтруют и отбирают 1 мл субстрата в сухую пробирку.Туда же вносят 5 мл раствора карбоната натрия и 1 мл реактива Фолина. Полученный раствор используют в качестве сравнения при замерах.

Протеолитическую активность (Ер) препарата (в ед/г) определяют по формуле:

где Ер– протеолитическая активность, ед/г; D –оптическая плотность;

4 – отношение объемов реакционной смеси и раствора фермента после добавления трихлоруксусной кислоты;

ТЭ – тирозиновый эквивалент; 10 – время гидролиза, мин;

а – количество ферментного препарата в пробе, мг; 1000 – пересчет в ед/г.

Тирозиновый эквивалент определяют для каждого фотоэлектроколориметра и реактивов путем построения градуировочной кривой.

Материалы и реактивы. Ферментативный препарат; казеинат натрия, 2 %– ный раствор; 0,1 М раствор универсального буфера, рН 5,5; 0,3 М раствор трихлоруксусной кислоты; 0,2 н. раствор соляной кислоты; 0,5 М раствор карбоната натрия; реактив Фолина (см. Приложени 1, п. 8); тирозин.

Оборудование. Фотоэлектроколориметр; центрифуга; термостат; стаканы на 50 мл; колбы мерные на 50, 100, 1000 мл; пробирки на 10, 20 мл; пипетки на 2,5 мл.

4.2.3. Определение активности протеолитических ферментов

Определение суммарной активности

Отдельные группы протеолитических ферментов проявляют максимальную активность при различной кислотности среды, поэтому их активность следует определять при различных значениях рН. Ниже приведен один из распространенных способов определения суммарной активности протеолитических ферментов, в основу которого положен метод Ансона.

Принцип метода. Ферментным препаратом, выделенным из растительного материала, действуют на раствор стандартного белка (казеина или гемоглобина), затем неразложившийся белок осаждают, а в фильтрате определяют количество разложившегося белка по колориметрической реакции Фолина или на спектрофотометре. Принимается, что количество разложившегося белка пропорционально содержанию в растворе тирозина. Рассчитывают протеолитическую активность ферментного препарата на 1 мг белка или на 1 г навески за 1 ч.

34

Ход работы. Навеску взвешивают на аналитических весах: при анализе свежего растительного материала 5 г, а семян – 2 г. Свежий растительный материал растирают в ступке с жидким азотом, а сухой – с песком и переносят в коническую колбу. Ступку смывают водой. Общий объем воды, добавляемой к навеске, должен быть 50 мл. После этого суспензию настаивают в течение 1 ч в холодильнике при периодическом помешивании. После настаивания суспензию фильтруют в сухой стакан или колбу через складчатый фильтр или осадок отделяют центрифугированием в течение 10–15 мин при 5–6 тыс. об/мин. В качестве ферментного препарата используют фильтрат или надосадочную жидкость.

При определении активности протеолитических ферментов в 2 пробирки приливают по 2 мл ферментного препарата. В одну из пробирок (контрольную) прибавляют 4 мл 14%–ного раствора трихлоруксусной кислоты для инактивации фермента. Затем в пробирки добавляют по 2 мл субстрата (1%–ного раствора казеина или 1%– ного гемоглобина) и тщательно перемешивают. Пробирки инкубируют на водяной

бане при 30° С точно 30 мин. За это время под действием протеолитических ферментов частично гидролизуется внесенные в опытную пробирку казеин или гемоглобин.

Через 30 мин в опытную пробирку для прекращения действия ферментов добавляют 4 мл 14 %–ного раствора трихлоруксусной кислоты. После этого содержание пробирок фильтруют через плотный фильтр (фильтрат должен быть совершенно прозрачным) и в фильтрате определяют количество тирозина, образовавшегося в результате расщепления белков под действием протеолитических ферментов.

Количество тирозина определяют по реакции с реактивом Фолина. Для этого к 0,5 мл фильтрата из каждой пробирки добавляют по 0,5 мл 0,0025 М раствора СuSО4, по 4 мл 0,5 н. раствора NаОН и по 1,5 мл разбавленного в 3 раза реактива Фолина. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и через 20–30 мин после стабилизации окраски определяют оптическую плотность на спектрофотометре при 760 нм или фотоэлектроколориметре с красным светофильтром.

Вычисление результатов. При спектрофотометрических определениях вычисляют разность D0–Dк, где D0– оптическая плотность опытного образца, Dк – оптическая плотность контрольного образца. Протеолитическую активность препарата выражают в единицах протеолитической активности на 1 мг белка, содержащегося в ферментном препарате (для этого необходимо определить содержание белка в нем), или на 1 г навески растительного материала за 1 ч.

Пример расчета. Допустим, что оптическая плотность опытного образца 0.400, а контрольного 0,240, т. е. разность составляет 0,160. Навеска материала 2 г. Разбавление 50 мл. Для анализа взято 2 мл ферментного препарата, что соответствует навеске 0,08 г. Для пересчета протеолитической активности на 1 г необходимо 0,160 разделить на 0,08, что дает 2,00 за 30 мин, а для перевода на 1 ч результат умножают на 2. Таким образом, условная протеолитическая активность исходного материала составляет 4,00 единицы.

Общая формула для расчета: