9738_Metodichka_virusologiya

Вінницький національний аграрний університет

Кафедри ентомології, фітопатології та захисту рослин

Практикум

для проведення лабораторних робіт із дисципліни «Сільськогосподарська мікробіологія та вірусологія»

для студентів зі спеціальності 6.090101 «Агрономія»

Вінниця 2010

Наведені лабораторні роботи щодо вивчення дисципліни «Сільськогосподарська мікробіологія та вірусологія». З кожної теми викладені мета, матеріали і обладнання, хід занять, а також контрольні питання.

Для студентів зі спеціальності 6.090101 «Агрономія».

Затверджено методичною комісією агрономічного факультету Вінницького національного аграрного університету

Автори: доценти Т.М. Коваленко, Н.В. Пінчук, Т.О. Буткалюк, Окрушко С.Є., ст. викл. П.М. Вергелес.

Рецензенти: доцент М.В. Первачук Вінницького національного аграрного університету С.І. Іванюк зав. лабораторіїселекції сої і зернобобових культур Інституту кормів НААН

Навчальне видання

Практикум

для проведення лабораторних робіт із дисципліни «Сільськогосподарська мікробіологія та вірусологія»

для студентів зі спеціальності 6.090101 «Агрономія»

Автори: Коваленко Тетяна Мефодіївна Пінчук Наталія Володимирівна, Буткалюк Тетяна Омельянівна, Окрушко Світлана Євгенівна Вергелес Павло Миколайович

Відповідальний за випуск доцент Коваленко Т.М.

Вступ

Сільськогосподарська мікробіологія та вірусологія ― одна із фундаментальних та основних дисциплін біології, яка вивчає світ бактерій (мікроорганізмів). Знання структури,

функцій та особливостей існування мікроорганізмів в біогеоценозі дозволяє вирішувати важливі проблеми екології, сільського господарства із раціональним використанням продуктів мікробного синтезу для підвищення родючості ґрунтів, охорони та відновлення довкілля, видобутку корисних копалин, отримання цінних біотехнологічних продуктів

(антибіотиків, органічних кислот, вітамінів, ферментів, біопестицидів тощо). Швидкий розвиток сучасної мікробіології та її методів вимагає постійного оновлення та модернізації навчальної літератури та матеріальної бази.

Приведені "Методичні вказівки" складені відповідно до програми курсу

«Сільськогосподарська мікробіологія та вірусологія» і є методичним посібником для студентів із спеціальності «Агрономія» при виконанні лабораторних робіт. Методичні вказівки розраховані на виконання студентами загальновідомих методів, які є класичними і не вимагають специфічного і складного обладнання.

При складанні методичних вказівок авторами видання враховані досягнення мікробіології останніх років в напрямках структури і функцій бактеріальних клітин,

фізіології обміну речовин у мікроорганізмів, їх ролі в ґрунтових процесах і житті рослин.

Приводяться методи мікроскопічних досліджень, вивчення морфології різних груп мікроорганізмів, техніка посівів і виділення чистих культур, методи виділення мікрофлори повітря, ґрунту, води.

Освоєння студентами цих навиків дозволить студентам застосовувати їх як для виконання лабораторних занять, так і в подальшій науково-дослідній та виробничій роботі.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 1

Тема: Мікробіологічна лабораторія та мікроскопія

Мета: Ознайомитись з умовами, які повинні бути в мікробіологічній лабораторії та кімнатами мікробіологічної лабораторії. Вивчити техніку безпеки при роботі в лабораторії. Ознайомитись з будовоюсвітлового мікроскопа та правилами роботи зним.

Матеріали та обладнання: Мікроскоп світловий та біологічні мікроскопи серії XSM – 10, XSM – 20, предметні та накривні скельця, препарувальні голки, мікробіологічна петля, шпатель, пробірки, піпетки.

План

1.Техніка безпеки при роботі в мікробіологічній лабораторії.

2.Мікробіологічна лабораторія.

3.Мікроскоп і мікроскопія.

1. ТЕХНІКА БЕЗПЕКИ ПРИ РОБОТІ В МІКРОБІОЛОГІЧНІЙ ЛАБОРАТОРІЇ

1.Заходити і працювати в мікробіологічній лабораторії тільки в халаті.

2.Не вносити в лабораторію сторонніх речей.

3.Працювати на одному й тому ж місці та користуватись закріпленим обладнанням.

4.Дотримуватись чистоти і охайності при роботі.

5.Не допускаються зайві розмови.

6.Щоб уникнути зараження під час перерв не палити і не вживати їжу.

7.На столі повинно бути тільки необхідне для виконання завдання.

8.Студент несе повну відповідальність за закріплені за ним мікроскопи, обладнання, реактиви і посуд на робочому місці.

9.Не запалювати одну спиртівку від іншої, використовувати для цього сірники.

10.Не торкатись металічними чи іншими предметами до проводів і контактних частин електромережі.

11.Без відома викладача або обслуговуючого персоналу не включати електроприлади і апаратуру.

12.Дотримуватись правил поводження з хімічними і іншими реактивами.

13.Після завершення робоче місце і обладнання приводити в порядок.

14.Після роботи металевий інвентар (бактеріологічні петлі, пінцети, тощо) необхідно прокалити у полум’ї пальника і здати.

15.Використані предметні і покривні скельця та шпателі помістити у посуд із дезинфікуючою рідиною.

16.По закінченню роботи необхідно вимкнути всі електроприлади.

17.По закінченні заняття треба помити посуд, прибрати робоче місце.

18.Черговий студент повинен здати лаборанту кафедри інвентар і приведене в порядок робоче місце та в цілому лабораторію.

19.Виходячи з лабораторії, з милом добре вимити руки.

2.МІКРОБІОЛОГІЧНА ЛАБОРАТОРІЯ

Мікробіологічна лабораторія ― це установа, яка виконує різні мікробіологічні дослідження: бактеріологічні, мікроскопічні, біохімічні, тощо.

Матеріалом дослідження, як правило, є зразки ґрунту, хворих рослин, харчові продукти, повітря, вода та ін.

Приміщення лабораторії або кабінету, де проводяться заняття з мікробіології, має бути сухим і світлим. У ньому треба дотримувати чистоти, оскільки в повітрі й на різних предметах завжди є велика кількість різних мікроорганізмів. Щоб приміщення лабораторії завжди було чистим, його необхідно провітрювати і щодня проводити в ньому вологе прибирання із використанням дезінфікуючих розчинів (найчастіше для цього використовують 3%-й розчин соди), фенольний розчин або опромінювання бактерицидними

По закінченню занять поживні середовища з посівами вміщують у термостати, музейні культури ― у холодильники, прибирають робочі місця, старанно миють руки, а при необхідності обробляють їх дезінфікуючим розчином.

Реактиви і деякі інші біологічні препарати зберігають в підвальному приміщенні або в темній шафі, де сухо, невисока температура і немає різких її коливань протягом року.

Кислоти та луги зберігають під витяжною шафою.

Приміщення мікробіологічної лабораторії

Приміщення мікробіологічної лабораторії повинно бути ізольованим і мати лабораторну кімнату, бокс з передбоксником, мийочну, середовищеварочну, автоклавну, матеріальну кімнату, термостатнута ін..

Матеріальна кімната ― використовується для зберігання поживних середовищ, реактивів, приладів і апаратури. Вонаобладнана стелажами, шафами, холодильниками та має гарну вентиляцію.

Препараторська ― це місце роботи обслуговуючого персоналу і підготовки оснащення. Тут розміщують холодильник, дистилятор, терези (аналітичні, торсійні, технічні), центрифугу і інше.

Мийочна кімната ― призначена для миття посуду. Мийочна кімната повинна мати столи, раковини, електричні чи газові плити, сушильну, витяжну і інші шафи. Підлога і стіни облицьовані кахлем. Для миття посуду використовують миючі засоби. Посуд миють в спеціальних рукавицях.

Середовищноварна ― це кімната для приготування поживних середовищ. Стіни повинні бути облицьовані плиткою або пофарбовані масляною фарбою. Підлога повинна бути вистелена плиткою або лінолеумом. В середовищоварній необхідно мати газову або електричну плиту, ящики з відсіками для середовищ в пробірках, шафи для зберігання середовищ, холодильник.

Стерилізаційна (автоклавна) кімната ― призначена для стерилізації поживних середовищ, інструментів, посуду та вибракованого матеріалу з мікроорганізмами (в спеціальних бюксах). Стерилізаційна кімната, повинна бути ізольована від інших приміщень. Двері і вікна повинні відкриватись назовні. В кімнаті повинна бути добра вентиляція. Стерилізаційна кімната ― містить один або два стерилізатора (автоклави), сушильні шафи і столи.

Бокс-кімната ― це ізольоване приміщення, яке використовується для посівів та пересівів культур мікроорганізмів, тут розливають середовища і проводять науково-дослідні роботи, які вимагають стерильних умов. У бокс-кімнаті скло має бути добре промазане, щоб не проникало повітря з навколишнього середовища, а разом з ним мікроорганізми. Стіни повинні були облицьовані плиткою або фарбовані білою масляною фарбою. Підлога покрита лінолеумом. Стіл в боксі повинен мати поверхню, яка легко дезінфікується (лінолеум, пластик). На столі розміщують спиртовий пальник, сірники, банку з дезінфікуючим засобом, вату, штатив з пробірками, бактеріологічні петлі. Перед роботою порожній бокс дезінфікують опромінюючи бактерицидними (УФ) лампами.

Передбоксник (тамбур) з розсувними дверима ― призначений для зберігається посуд, середовищ, інвентарю та одягу перед посівом. Перед початком роботи у передбокснику одягають робочий халат. У передбокснику мають бути вішалки для одягу, шафи для інвентарю та середовищ. Підчас підготовки до проведення робіт порожній передбоксник опромінюють бактерицидними (УФ) лампами.

Термостатна кімната ― призначена для дорощування культур мікроорганізмів після посівів та пересівів. Термостатна кімната має термостати різних форм і розмірів (ТС -80), які забезпечують культурам оптимальний температурний режим.

Віварій ― це приміщення, де утримують білих мишей і щурів, морських свинок, кроликів і інших лабораторних тварин.

У всіх приміщеннях бактеріологічної лабораторії підлога повинна бути вкрита плиткою чи лінолеумом,стіниістеляпофарбованісвітлоюмасляноюфарбою.

МІКРОСКОП І МІКРОСКОПІЯ

Мета роботи: ознайомитись з будовою і правилами користування мікроскопом з імерсійним та сухим об’єктивами.

Обладнання і матеріали: мікроскоп, імерсійне масло, препарати мікроорганізмів. Якщо вважати, що мікробіологія виникла тоді, коли людина вперше побачила і

описала мікробів, то можна точно встановити «день народження» науки та ім’я її засновника. Цією людиною є голландський натураліст Антоні Ван Левенгук (1632—1723). Виготовлені Левенгуком мікроскопи були найдосконалішими на той час (рис. 3). Вони збільшували досліджуваний об’єкт у 160—300 разів.

Рис. 3. Мікроскоп А. Левенгука: А, В ― вигляд ззовні; Б ― схема будови: 1 ― щілина; 2 ― рухома голка, на якій вміщується досліджуваний об’єкт; 3 ― гвинт для наведення різкості

Серед різноманітних приладів, що використовуються в практиці мікробіологічних досліджень, найважливіше місце належить мікроскопу.

Мікроскопом називається прилад з певним розташуванням лінз у ньому, за допомогою яких досліджуваний об’єкт збільшується в сотні й тисячі разів. Мікроскопи, які дають можливість вивчати різні прозорі об’єкти у світлі, що проходить через лінзи, називаються

світловими або біологічними (рис. 4).

Рис. 4. Біологічні мікроскопи серії «БИОЛАМ» (А - МБР-1; Б - МБР-3):

1 — основа; 2 — коробка з механізмом мікрометричного фокусування; 3 — рукоятка мікрогвинта; 4 — предметний столик; 5 — гвинт для фіксування диска предметного столика; 6 — регулювальні гвинти; 7 — тубусотримач; 8 — рукоятка макрогвинта; 9 — головка; 10 — насадка; 11 ― гвинт для закріплення насадки; 12— револьвер; 13 — гвинт фіксування револьвера; 14 ― кронштейн конденсора;15 — рукоятка конденсора; 16 ― циліндрична гільза конденсора; 17— гвинт; 18 — додаткова лінза (відкидна); 19 ― дзеркало

Мікроскоп має дві системи:

1)механічну;

2)оптичну.

У механічній системі основними частинами є прямокутна основа (штатив), коробка з мікрометричним механізмом, предметний столик, тубусотримач з макрогвинтом, тубус, револьвер з отворами дляоб’єктивів.

Рух системи забезпечується обертанням макрометричного і мікрометричного гвинтів.

Оптична система, складається з:

-спостережної системи (об’єктив, окуляр);

-освітлювального системи (конденсор, дзеркало, діафрагма, відкидна лінза, світлофільтр, освітлювач).

Основною частиною оптичної системи є об’єктив, що характеризує основні якості мікроскопа: власне збільшення, роздільну здатність і чіткість зображення.

Об’єктив ― це система лінз у металевій оправі. Передня, найголовніша лінза об’єктива, називається фронтальною. Вона дає зображення об’єкта, що розглядається, із сферичною і хроматичною абераціями. Останні усуваються розміщеними вище в об’єктиві корегуючими лінзами. В об’єктивах планахроматах і планапохроматах сферична і хроматична аберації є виправленими. При роботі з цими об’єктивами найкращий ефект досягається тільки при одночасному використанні компенсаційних окулярів. Об’єктив збільшує у 8, 40, і 90 разів. Дозволяючи здатність мікроскопу— 0,2 мкм (мікрометрів).

Розрізняють об’єктиви:

-сухі (повітряні);

-імерсійні (занурені).

Під час користування сухими об’єктивами 8х, 40х між фронтальною (передньою) лінзою і об’єктом спостереження міститься шар повітря, в якому заломлюється і відхилюється частина світлових променів від об’єктиву. Найчастіше користуються сухими об’єктивами при збільшені досліджуваного об’єкта від 56 до 600 разів.

Імерсійні об’єктиви (ОИ-90 або МИ-90) застосовують при вивченні дуже дрібних об’єктів (бактерій, грибів тощо). В імерсійних об’єктивах із збільшенням 90х, між фронтальною лінзою і досліджуваним об’єктом міститься крапля імерсійної олії, найчастіше кедрове масло або гліцерин. У цій однорідній системі промені світла не заломлюються, а потрапляють в об’єктив, не змінюючи свого напрямку, оскільки показники заломлення скла і кедрової олії майже однакові: 1,52 і 1,515 відповідно. Часто використовують також синтетичні продукти, які за оптичними властивостями не поступаються кедровій олії (рис. 5).

Рис. 5. Хід променів в імерсійній системі:

1 — предметне скельце, ή=1,520;

2 — імерсійна олія, ή =1,515;

3 — фронтальна лінза імерсійного об’єктива;

4 — повітря, ή =l,0; вода, ή=l,3

Власне збільшення будь-якого об’єктива залежить від фокусної відстані його

фронтальної лінзи. Власне збільшення обєктива визначають за формулою

V=L / F де,

V ― власне збільшення об’єктива;

L ― відстань між фокальною площиною об’єктива і площиною зображення (для різних об’єктивів вона становить 128―180 мм);

F ― фокусна відстань об’єктива. У найсильніших об’єктивах фокусна відстань фронтальної лінзи дорівнює 1―3 мм, а у найслабкіших ― 50―60 мм.

До оптичної системи мікроскопа також належить окуляр, який складається з двох плоско-опуклих лінз: верхньої очної і нижньої ― збірної. Очна лінза збільшує дійсне зображення, одержане об’єктивом, подібно до звичайної лупи. Цифри на металевій оправі окуляра (5х, 7х, 10х, 15х, 20х) вказують на його власне збільшення.

Власне збільшення окуляра визначається за формулою: K=-L / F де,

К ― власне збільшення окуляра;

L ― відстань найяснішого поля зору для нормального ока, яка дорівнює 25 см; F ― фокусна відстань лінз окуляра.

Як і об’єктиви, окуляри також бувають різних типів. Вибір того чи іншого залежить від об’єктива.

Для роботи з ахроматичними об’єктивами малого і середнього збільшення найчастіше використовують окуляри Гюйгенса або ортоскопічні окуляри.

Для роботи з апохроматичними, планахроматичними і ахроматичними об’єктивами великого збільшення використовують компенсаційні окуляри (АМ-27 15х та інші).

У разі тривалої роботи з мікроскопом користуються бінокулярною насадкою, яка має власне збільшення близько 1,5х і обладнана корекційними лінзами. Праця з цими насадками зберігає зір.

Загальне збільшення мікроскопа дорівнює добутку збільшення об’єктива помноженому на збільшення окуляра.

V = Vок • Vоб де,

V ― загальне збільшення мікроскопу; Vок ― збільшення окуляру;

Vоб ― збільшення об’єктиву.

Наприклад, при використанні окуляра 15х і об’єктива 90х матимемо збільшення зображення у 1350 разів.

Основними складовими частинами освітлювального пристрою, розміщеного під предметним столиком є:

- конденсор; -дзеркало.

Конденсор складається з двох лінз у металевій оправі та ірисової діафрагми. Він призначений для збирання пучка світла від дзеркала.

Дзеркало має плоску і вгнуту поверхні. Воно спрямовує пучок променів на об'єкт, що досліджується. При денному освітленні користуються плоскою стороною дзеркала, при штучному освітленні (а також при відсутності конденсора) ― вгнутою.

Оптичні якості мікроскопа визначаються такими основними показниками: власним збільшенням, роздільною здатністю і чіткістю зображення. Власне збільшення мікроскопа перебуває в оберненій залежності від фокусної відстані фронтальної лінзи об’єктива: чим більшою є фокусна відстань, тим меншим є збільшення фронтальної лінзи.

Роздільна здатність мікроскопа ― це здатність об’єктива давати роздільне зображення двох близько розташованих на препараті точок. Іншими словами це та мінімальна відстань між двома точками, коли вони ще не зливаються в одну. Чим більша роздільна здатність мікроскопа, тим меншого розміру об’єкт можна побачити. Роздільна здатність мікроскопа є тим більшою, чим вищою є нумерична апертура об’єктива.

Нумерична апертура визначає здатність оптичної системи сприймати ту чи іншу

кількість світла, її визначають за такою формулою:

А = η х sin α / 2 де,

А ― нумерична апертура; η ― показник заломлення світла у середовищі між об’єктом і об’єктивом;

sin α / 2 ― половина отвірного кута, що утворюється двома крайніми променями, які потрапляють в об’єктив.

Величина роздільної здатності мікроскопа залежить від довжини хвилі світла і суми числових апертур об’єктива та конденсора:

L = λ де,

А1 + А2

L ― роздільна здатність; λ ― довжина хвилі світла;

А1 ― нумерична апертура об’єктива; А2 ― нумерична апертура конденсора.

Наприклад, якщо у мікроскопі «Биолам 70-Р» нумерична апертура об’єктива 40х дорівнює 0,65, а конденсора ― близько 1, то в цьому випадку роздільна здатність мікроскопа при використанні світла з довжиною хвилі 0,55 мкм дорівнюватиме

Максимальна роздільна здатність світлового мікроскопа складає 0,2 мкм.

Чим більшою є величина α / 2, тим вищою є числова апертура і роздільна здатність об’єктива. Щоб підвищити цю величину при використанні імерсійного об’єктива, необхідно максимально підвищити конденсор, оскільки цим визначається його світлозбиральна функція.

Чіткість зображення. Чітке зображення об’єкта під мікроскопом утворюється при загальному збільшенні об’єктива та окуляра, яке не перевищує нумеричну апертуру більш ніж у 500 разів. Чіткість зображення залежить від ступеня усунення в об’єктиві явищ сферичної і хроматичної аберацій. З цією метою використовують планахроматичні і планапохроматичні об’єктиви.

ОСНОВНІ ПРАВИЛА КОРИСТУВАННЯ СВІТЛОВИМ МІКРОСКОПОМ

З мікроскопом треба працювати обережно. Не можна ставити його біля запаленого пальника. Слід підготувати мікроскоп до роботи: протерти лінзи окуляра і об’єктива м’якою серветкою.

Перед початком роботи вибирають місце подалі від прямого сонячного світла і встановлюють мікроскоп перед собою так, щоб було зручно дивитися в окуляр. Спочатку необхідно відрегулювати віддаль між окулярами відповідно до відстані між очима спостерігача так, щоб поля зору обох окулярів злилися в одне. Потім регулюють освітлення. Для цього, дивлячись лівим оком в окуляр, повертають плоску поверхню дзеркала, щоб світло сонця або електричної лампи, відбиваючись від поверхні дзеркала, яскраво і рівномірно освітлювало все поле зору. Аби домогтися цього, треба повністю підняти конденсор, опустити об’єктив (8х) на відстань 0,5—1 см від предметного столика, вийняти окуляр і, дивлячись у тубус, повертанням дзеркала вловити зображення джерела світла. Після цього знову вставити окуляр і починати вивчення досліджуваного об’єкта.

КОРИСТУВАННЯ ІМЕРСІЙНОЮ СИСТЕМОЮ В мікробіологічній практиці найчастіше вивчення бактерій та інших мікроорганізмів

здійснюють за допомогою імерсійних об’єктивів. За цього випадку спочатку встановлюють дзеркало плоскою стороною і піднімають конденсор. Фіксований або живий препарат вміщують на предметний столик і закріплюють затискувачами, приступають до попереднього огляду його з об’єктивом 8х. На центральну ділянку препарату наносять краплину імерсійної олії. Повертають револьвер на об’єктив 90х. Після цього, під контролем