9738_Metodichka_virusologiya

Рис. 37. Оцтовокислі бактерії (за К.М. Векірчик, 2001):

А — Acetobacter aceti; Б — Acetobacter pasteurianum; В — Acetobacter xylinum.

Контрольні питання

1.Назвіть збудників спиртового бродіння.

2.Культурні дріжджі за способом зброджування цукрі поділяються на дві групи. Які?

3.Значення дріжджів у природі і практиці.

4.Назвіть та дайте характеристику типів молочнокислого бродіння.

5.Морфологія молочнокислих бактерій.

6.Практичне значення і використання молочнокислих бактерій.

7.Охарактеризуйте процес маслянокислого бродіння.

8.Значення процесу маслянокислого бродіння.

9.Які етапи проходить процес бродіння пектинових речовин?

10.Охарактеризуйте процес неповного окислення оцтовокислих бактерій.

11.Практичне значення і використання оцтовокислих бактерій.

12.Охарактеризуйте процес бродіння клітковини.

13.Дайте характеристику процесу окислення клітковини.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 11

Тема: Перетворення мікроорганізмами азоту і його сполук

Мета: Вивчити особливостіпроцесів перетворення мікроорганізмів азотнихсполук уґрунті. Матеріали та обладнання: 1) Біологічні мікроскопи XSM – 10, XSM – 20, 2) предметні та

накривні скельця, 3) культура мікроорганізмів, 4) фільтрувальний папір, 5) спиртівка, 6) мікробіологічна петля, 7) дистильована вода, 8) термостат; 9) скальпелі; 10) колби Ерленмеєра (100 мл); 11) піпетки і пробірки; 12) шпателі, 13) чашки Петрі, 14) ґрунт, 15) туш, 16) середовище, Ешбі, 17) сира картопля, 18) розчин Люголя, 19) крейда, 20) бритви; 21) скальпелі; 22) препарувальні голки; 23) стерильна вода, 24) пінцети, 25) скальпелі, 26) 96 %-ний етиловий спирт, 27) свіжі корені з бульбочками різних бобових рослин.

План

1.Азотфіксація.

2.Амоніфікація.

3.Іммобілізація

4.Нітрифікація.

5.Денітрифікація.

ПЕРЕТВОРЕННЯ АЗОТОВМІСНИХ СПОЛУК

Азот є одним із елементів, від якого залежить доля врожаю рослин. Він є невід’ємним складником білків, ДНК і РНК, АТФ, ферментів та інших важливих сполук. У середовищі, яке оточує рослину, азот перебуває у вигляді газоподібної молекулярної сполуки (N2), що становить близько 80% об’єму повітря. В ґрунті зв’язаний азот трапляється у вигляді солей амонію (NH+4), нітратного і нітритного азоту (NO-3, NO-2), білкового азоту (рештки) і азоту, що входить до складу ґрунтового гумусу.

Перетворення сполук азоту в ґрунті — складний процес, він відбувається під дією мікроорганізмів, які в процесі життєдіяльності здійснюють перетворення азоту:

фіксація молекулярного азоту атмосфери вільноживучими і симбіотичними мікроорганізмами;

гниття білків, або амоніфікація;

іммобілізація — процес в результаті якого наявні в ґрунті мінеральні форми азоту внаслідок бурхливого розвитку мікроорганізмів споживаються ними

окислення амонійних форм азоту, або нітрифікація;

відновлення нітратів до молекулярного азоту — денітрифікація.

І. АЗОТФІКСАЦІЯ

Біологічна фіксація атмосферного азоту — процеси зв’язування молекулярного азоту атмосфери мікроорганізмами. Підвищує родючість ґрунту.

Мікроорганізми, які можуть зв’язувати молекулярний азот, розподіляють на групи:

-мікроорганізми, що перебувають у симбіозі (співжитті) з рослинами;

-азотофіксатори, які вільно живуть у ґрунті та воді.

ВІЛЬНОЖИВУЧІ АЗОТФІКСАТОРИ

Асоціативна азотфіксація — процес фіксації молекулярного азоту атмосфери мікроорганізмами, які містяться на корінні і в прикореневій зоні (ризосфері) небобових рослин.

Головними представниками вільноживучих (асоціативних) азотфіксаторів є аеробні бактерії родів Azotobacter, Beijerinckia, анаеробні бактерії роду Clostridium, a також багато видів ціанобактерій (синьо-зелені водорості). Типовий представник анаеробних азотфіксаторів — Clostridium pasteurianum може спричиняти маслянокисле бродіння.

Усі представники роду Azotobacter — аеробні, грамнегативні, великі клітини, живуть лише при нейтральній реакції (рН не нижче 6,0). Найпоширеніший вид — Azotobacter chroococcum (рис. 38).

Рис. 38. Азотобактер (Azotobacter chroococcum) (за К.М. Векірчик, 2001)

У молодому віці Azotobacter chroococcum — це паличковидні, рухомі клітини, з віком заокруглюються й розташовуються попарно. Клітини назовні оточені товстою слизовою капсулою. Бактерії цього виду утворюють темний пігмент меланін, який надає колоніям характерне буре забарвлення. За рік азотобактер фіксує 20—30 кг/га азоту.

Бактерії роду Beijerinkcia sp. відрізняються від роду Azotobacter sp. більшою стійкістю до кислотності ґрунтів і можуть розмножуватися при рН 3,0.

Нині відомо, що фіксувати молекулярний азот атмосфери можуть бактерії багатьох родів: Bacillus, Bejerinckia, Corynebacterium, Derxia, Desulfovibrio, Enterobacter, Ervina, Klebsiella, Pseudomonas, Spirillum, Аgrоbасtеrіum, Асhrоmоbасtеr, Аquаspіrіllum, Аzospіrillum, Аrthrobасtеr, Flаvоbасtеrіum, Flаvоbасtеrіum, Мyсоbасtеrіum, Rhоdоsріrіllum та ін.

Хід роботи. Для виділення з ґрунту азотобактера використовують агарове безазотисте середовище Ешбі. Його розплавляють і розливають у стерильні чашки Петрі. Коли середовище застигне, на його поверхні розкладають 50 грудочок ґрунту. Чашки ставлять у термостат при 28°С. Через 5—7 днів спостерігають утворення навколо грудочок ґрунту бурі плями слизистих колоній Az. chroococcum. Підраховують процент оброслих грудочок. З колоній готують мазки, фарбують фуксином 2 хв і мікроскопують.

СИМБІОТИЧНІ АЗОТФІКСАТОРИ

Бульбочкові бактерії роду Rhizobium, які живуть у симбіозі з бобовими рослинами. Рід Rhizobium — це група аеробних, грамнегативних, неспороутворюючих бактерій. Проникаючи всередину кореневих волосків бобових рослин, вони утворюють нарости — бульбочки різної форми, розмірів і забарвлення. У молодих бульбочках вони мають форму рухливих паличок з перитрихальним розміщенням джгутиків. З розвитком бактерії втрачають джгутики, стають нерухомими, розростаються і перетворюються на потовщені, роздуті грушоподібні або розгалужені утворення — бактероїди (рис. 39). В стадії бактероїда відбувається найінтенсивніше зв’язування бульбочковими бактеріями молекулярного азоту.

Бульбочкові бактерії характеризуються: вірулентністю, специфічністю і активністю. Вірулентність — здатність бактерій проникати в тканину кореня, розмножуватися там і

спричиняти утворення бульбочок.

Активністю — здатність бульбочкових бактерій у симбіозі з бобовими рослинами асимілювати молекулярний азот.

Штами бульбочкових бактерій бувають:

активні;

неактивні.

Активні штами утворюють великі рожеві бульбочки за рахунок наявності леггемоглобіну. В активних бульбочках азотфіксація відбувається дуже інтенсивно.

Неактивні штами бульбочкових бактерій утворюють на коренях дрібні зеленуваті бульбочки, в яких фіксація азоту не відбувається.

Специфічність — вибіркова здатність бульбочкові бактерії відносно утворення активних бульбочок з бобовими рослинами.

Рис. 39. Бульбочкові бактерії: А — палички; Б – бактероїди

(за К.М. Векірчик, 2001)

Бактерії роду Rhizobium за специфічністю до бобових культур поділяють на групи: R. lеgumіnоsаrum — гороху, вики, кормових бобів, чини; R. phаsеоlі — квасолі; R. jароnісum — сої; R. vignа — вігни, арахісу, машу; R. cісеr — нугу; R. luріnі — люпину, серадели; R. trіfоlii

— конюшини.

Бульбочкові бактерії у симбіозі з бобовими рослинами можуть зв’язати за рік азоту: з люцерною — 500, з конюшиною — 300, з люпином — 150, з зернобобовими 60—90 кг/га.

Хід роботи. Відібрати свіжий корінь бобової рослини з добре розвиненими бульбочками, промити у воді і відрізати від нього найбільші бульбочки. Для знищення поверхневої мікрофлори, їх стерилізують 5 хв у 96%-му етиловому спирті, а потім відмивають 5-кратно стерильною водою (переносять бульбочки послідовно у 5 пробірок із стерильною водою). Стерилізовану бульбочку кладуть у стерильну чашку Петрі, роздавлюють на шматочки профламбованим пінцетом або скальпелем, додають кілька крапель стерильної води. Готують фіксований препарат «роздавлена крапля», фарбують фуксином 2 хв, продивляють у мікроскоп з імерсією.

ІІ. АМОНІФІКАЦІЯ

Амоніфікація — процес мінералізація органічних сполук азоту з утворенням вільного аміаку.

Рослини живляться переважно мінеральними формами азоту. В ґрунті основна маса азоту знаходиться у формі органічних сполук (білки, нуклеїнові кислоти, сечовина), які потрапляють у ґрунт з рослинними та тваринними рештками, з гноєм.

Амоніфікації підлягають білки, нуклеїнові кислоти, сечовина, хітин, сечова та гіпурова кислоти, ціанамід кальцію, гумус. Вона відбувається в аеробних та анаеробних умовах, і в цьому процесі беруть участь багато різноманітних мікроорганізмів-амоніфікаторів. Мікроорганізми-амоніфікатори бактерії, актиноміцети, цвільові гриби та інші. Мікробиамоніфікатори виділяють у довкілля протеолітичні ферменти, які розкладають органічні сполуки.

АМОНІФІКАЦІЯ БІЛКОВИХ РЕЧОВИН

Мікроби-амоніфікатори виділяють у довкілля протеолітичні ферменти, які розкладають білки до амінокислот. Потім амінокислоти дезамінуються, внаслідок чого

утворюються органічні кислоти, аміак, сірководень та інші продукти розпаду.

Наприклад, гідролітичне дезамінування супроводжується утворенням оксикислот і аміаку:

R - СНNН2СООН + Н2О → R - СНОНСООН + NH2

Мікроорганізми, які розкладають органічні речовини (рис. 40): Pseudomonas, Clostridium, Bacillus (В. subtilis, В. cereus, В. mycoides, В. putrificus, Ps. fluorescens та ін).

Рис. 40. Збудники амоніфікації білкових речовин:

І— колонії; (за К.М. Векірчик, 2001)

ІІ— клітини 1 — 3 — денної культури на МПА;

А — В. Subtilis;

Б — В. mesentericus; В — В. mycoides

Амоніфікація білків відбувається під впливом мікробних ферментів-протеаз, які викликають гідроліз білків. Амінокислоти надходять до мікробних клітин і розщеплюються з утворенням NH3 та різних органічних сполук.

Амоніфікація білків може відбуватися в:

аеробних умовах;

анаеробних умовах.

Ваеробних умовах при розкладанні (мінералізації) білка всі органічні сполуки окислюються до СО2 й Н2О, кінцевими продуктами процесу амоніфікації є аміак NH3, СО2, Н2О і H2S, солі сірчаної і фосфорної кислот.

Ванаеробних умовах утворюється не відбувається їхньої повної мінералізації, тому крім NH3 і СО2 утворюється ще низка речовин, наприклад органічні кислоти, спирти, аміни, індол, скатол, меркаптани, H2S, СО2. При амоніфікаціїї лізину утворюється трупна отрута — кадаверин.

АМОНІФІКАЦІЯ СЕЧОВИНИ

Сечовина — кінцевий продукт перетворення азотних сполук в організмі людини і тварин. Вона може також синтезуватися деякими іншими організмами. У великих кількостях сечовину використовують як цінне азотне добриво.

Амоніфікацію сечовини спричиняють ґрунтові мікроорганізми, які можуть виділяти фермент уреазу. Цей фермент гідролізує сечовину до утворення NH3, і СО2:

Уреаза

CO(NH2)2 +2Н20 → (NH4)2CО3,

(NH4)2 CО3 → 2NH3 +СО2 +Н2О.

Бактерії, що гідролізують сечовину, дістали назву уробактерій. До них належать

Bacillus pasteurii, Micrococcus ureae, Planosarcina ureae (рис. 41) та інші.

Рис. 41. Збудники амоніфікації сечовини — уробактерії:

А — Bacillus pasteurii; Б — Planosarcina ureae (за К.М. Векірчик, 2001)

Аміак, який утворюється при амоніфікації, частково засвоюється рослинами, адсорбується ґрунтом, включається в інші мікробіологічні процеси.

ІІI. ІММОБІЛІЗАЦІЯ

Іммобілізація — процес в результаті якого наявні в ґрунті мінеральні форми азоту внаслідок бурхливого розвитку мікроорганізмів споживаються ними і переводяться в білок цитоплазми, також можуть використовуватись як джерело енергії для розщеплення вуглецевих сполук

IV. НІТРИФІКАЦІЯ

Нітрифікація — це мікробіологічний процес окислення аміаку і солей амонію (які утворюється в ґрунті, гною, водоймах внаслідок амоніфікації) в азотисту, а потім в азотну кислоту.

С.М. Виноградський встановив, що нітрифікація — це процес послідовної дії двох груп мікроорганізмів (рис. 42).

Рис. 42. Нітрифікуючі бактерії:

А — Nitrosomonas europea (овальні клітини);

Б — Nitrobacter (короткі паличкоподібні клітини). (за К.М. Векірчик, 2001)

Процес нітрифікації має дві фази, кожна з яких викликається специфічною групою аеробних бактерій:

1. Перша фаза нітрифікації — окислення аміаку в азотисту кислоту(нітрити). Окислення аміаку до азотистої кислоти здійснюється групою грамнегативних

бактерій: Nitrosomonas, Nitrosolobus, Nitrosococcus, Nitrosocyctis, Nitrosospira

2 NH3 + 3 О2 → 2 HNО2+ 2H 2О + енергія NH+4 + l/2O2 →NO-2+2H+ + H2O+279 кДж

2. Друга фаза нітрифікації — окислення азотистої кислоти в азотну (нітрати). Окислення азотистої кислоти до азотної спричиняється група бактерій: Nitrobacter,

Nitrospira, Nitrococcus.

2 NH02 + О 2 → 2 HNO, + енергія

NO-2 +1/2О2 →NO-3 +71,4 кДж.

Нітрифікуючі бактерії належать до типових хемолітоавтотрофів і є облігатними аеробами.

Процес нітрифікації має важливе значення для землеробства, тому що при нітрифікації утворюються солі азотної кислоти — нітрати, основне джерело азоту, яке засвоюється вищими рослинами.

V. ДЕНІТРИФІКАЦІЯ

Денітрифікація — це процес відновлення нітратів до нітритів і аміаку, а в кінцевому рахунку — до молекулярного азоту, денітрифікуючими бактеріями.

Денітрифікуючі бактерії — факультативні анаероби і при нестачі в середовищі вільного кисню використовують у процесах дихання як акцептор водню кисень нітратів, через що останні відновлюються, такий процес має назву нітратне дихання. Його можна виразити

таким рівнянням:

С6Н12О6 + 4NO-3 →6СО2 + 6H2O +2N2 + О

Розрізняють пряму і непряму денітрифікацію:

пряма — це результат життєдіяльності особливої групи денітрифікуючих бактерій;

непряма відбувається внаслідок хімічних реакцій між азотистою кислотою та амінними і амідними сполуками.

Роль мікробів при цьому зводиться тільки до утворення нітратів і аміносполук. Різні ґрунтові мікроорганізми — гетеротрофи (бактерії, гриби, актиноміцети) можуть здійснювати початковий етап денітрифікації -відновлення нітратів у нітрити. Є група специфічних денітрифікуючих бактерій, які відновлюють нітрати до молекулярного азоту. Більшість денітрифікаторів належать до родів Pseudomonas (P. denitrificans, P. fluorescens, P. stutzeri) —

грамнегативні, рухомі, неспороутворюючі палички, що забарвлюють середовище у жовтозелений колір пігментом, який ці палички продукують іMicrococcus denitrificans.

Молекулярний азот, що утворюється в процесі денітрифікації, вивітрюється з ґрунту в атмосферу і родючість ґрунту знижується. Денітрифікації піддаються й азотні добрива, які вносять у ґрунт, що зменшує ефективність їх дії. Денітрифікація вважається процесом, який збіднює ґрунти на доступні для рослин форми азоту.

Контрольні питання

1.Який процес називається азотфіксацією?

2.Охарактеризуйте особливості вільноживучих азотфіксаторів, назвіть головних представників цієї групи.

3.Як відбувається симбіоз бульбочкових бактерій із бобовими рослинами?

4.Дайте характеристику і назвіть бульбочкові бактерії.

5.Значення бульбочкових бактерій для землеробства.

6.Значення процесу амоніфікації для землеробства.

7.До найбільш поширених мікроорганізмів — амоніфікаторів відносять?

8.Як виявити продукти амоніфікації?

9.Значення процесу нітрифікації для землеробства.

10.Дайте характеристику процесу нітрифікації.

11.Охарактеризуйте і назвіть збудників 1 та 2 фази нітрифікації.

12.Значення денітрифікації для землеробства.

13.Поясніть суть денітрифікації.

14.Дайте характеристику і назвіть збудників процесу денітрифікації.

15.Які умови уґрунті сприяють денітрифікації? Назвіть заходи по обмеженню процесу.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 12

Тема: Біологічні добрива

Мета: Вивчити які на даний час існують біологічні добрива та їх переваги у порівнянні з хімічними парапетами.

Матеріали та обладнання: 1) пакети із субстратом біопрепаратів, 2) брошури про біологічні добрива.

План

1.Переваги біологічні добрив.

2.Ефективність бактеріальних добрив

3.Історія застосування добрив

4.Біологічні добрива.

І. ПЕРЕВАГИ БІОЛОГІЧНІ ДОБРИВА Переваги у застосуванні бактеріальних добрив:

1.Не забруднюється навколишнє середовище;

2.Отримуються екологічно чиста продукція;

3.Не мають негативного впливу на мікроорганізми ґрунту;

4.Підвищення родючості ґрунту;

5.Стимулюється розвиток рослин;

6.Підвищення урожайності культур.

ІІ. ЕФЕКТИВНІСТЬ БАКТЕРІАЛЬНИХ ДОБРИВ Ефективність застосування бактеріальних добрив залежить від:

-ґрунтово-кліматичних умов (волога, температура, рН ґрунту, органомінеральний склад ґрунту);

-якості біопрепарату (титру — кількість клітин бактерій в 1 г або 1 мл препарату, активності бактерій);

-строку зберігання біопрепарату;

ІІІ. ІСТОРІЯ ЗАСТОСУВАННЯ ДОБРИВ

Біологічні добрива. Поряд з іншими добривами в агровиробництві широко використовують бактеріальні препарати, виготовлені на культурах відповідних бактерій. Думка про використання бульбочкових бактерій для посилення фіксації N2 виникла після того, як М. Бейєрінку (1888) вдалося виділити чисту культуру цих бактерій з бобових рослин. Вперше препарат бульбочкових бактерій під назвою нітрагін було виготовлено в 1896 р. Ґрунтовий нітрагін — це розмножена культура бульбочкових бактерій на стерильному ґрунті.

Масове виготовлення цього бактеріального добрива в нашій країні почалося з 1929 р. Нині нітрагін випускають у двох формах — нітрагін сухий (ризорбін) та нітрагін торфовий (ризоторфін).

Багаторічна практика використання цього бактеріального добрива як в Україні, так і за кордоном свідчить про значну його ефективність. При цьому слід зазначити, що застосування нітрагіну веде не тільки до збільшення врожаю бобових рослин (пересічно на 10—15 %), а й до поліпшення їхньої якості, оскільки в оброблених рослинах виявлено помітне збільшення вмісту білка і вітамінів.

Вдаються й до інших видів бактеріального добрива. На пропозицію С.П. Костичева, ще в 30-х роках почали застосовувати препарати для удобрення ґрунту, які містили культуру

Аzоtobасtеr сhrоососсum.

Виробництво азотобактерину ґрунтується на розмноженні чистої культури азотобактера

ізмішуванні її з будь-яким субстратом (ґрунтом, торфом, агаром тощо). Азотобактерин використовують для підвищення врожайності зернових, технічних, овочевих та інших культур. У ґрунт його вносять разом з посівним матеріалом. Дія азотобактерину ґрунтується на використанні властивостей азотобактера, який крім фіксації молекулярного азоту може виробляти фізіологічно активні речовини, які стимулюють ріст рослин і цим сприяють підвищенню їхньої продуктивності. Середній приріст врожаю від застосування азотобактерину становить близько 10 %.

Екологічно чистий агрофіл використовують для підвищення врожайності овочевих культур, а біодобриво бамім —під картоплю і багаторічні трави. Для розкладання пестицидів

істимуляції росту рослин застосовують бактеріальний препарат агрофор.

ІV. БІОЛОГІЧНІ ДОБРИВА.

Регулювання діяльності мікрофлори ґрунту з метою мобілізації й залучення у кругообіг речовин таких важливих біогенних елементів, як азот, вуглець, фосфор, сірка та інші, має велике практичне значення.

Дійовим способом зміни кількісного та якісного складу мікроорганізмів ґрунту є штучне збагачення ризосфери рослин високоактивними корисними бактеріями при застосуванні біопрепаратів на основі мікроорганізмів.

Механізм дії цих препаратів полягає у тому, що бактерії, з яких виготовлено добриво, внесені у ґрунт разом з насінням, розмножуються у ризосфері рослин і в процесі своєї життєдіяльності поліпшують кореневе живлення, стимулюють ріст і розвиток рослин, виявляють антагоністичну та протекторну дію до певних фітопатогенних мікроорганізмів.

Біологічні добрива — це чиста культура живих найбільш активних штамів азотфіксуючих, фосфатмобілізуючих бактерій, які вирощені на поживних середовищах.

За допомогою бактеріальних добрив регулюється діяльність мікрофлори ґрунту з метою мобілізації й залучення у кругообіг речовин таких важливих біогенних елементів, як азот, фосфор, вуглець, сірка.

Дійовим способом зміни кількісного та якісного складу мікроорганізмів ґрунту є штучне збагачення кореневої зони рослин високоактивними корисними бактеріями.

Механізм дії біопрепаратів: бактерії з яких виготовлені біопрепарати, внесені у ґрунт разом з насінням розмножуються з насінням у ризосфері рослин і в процесі життєдіяльності поліпшують кореневе живлення, стимулюють ріст і розвиток росли, виявляють антогоністичну дію на певні фітопатогенні мікроорганізми.

За дотримання усіх вимог застосування біопрепаратів інокуляція є ефективною для однорічнихкультур.

Що стосується дворічних і багаторічних рослин, то найбільш ефективною є бактеризація у перший рік їх росту. У наступні роки вирощування, наприклад, багаторічних трав, дія інтродукованих бактеріальних культур знижується, а на третій рік вона є несуттєвою. Таке зниження чисельності інтродукованого штаму є закономірним, адже у природнихугрупованнях чисельність азотфіксаторів уризосферірослиннеперебільшує1—5%. Дотого ж селекціоновані у лабораторних умовах штами не витримують конкуренції з аборигенним мікробним угрупованням.

Ефективність дії мікробних препаратів бактеріальних добрив значною мірою залежить від взаємодіїрослин імікроорганізмів та здатностіостанніхприживатись, розмножуватись іактивно функціонувати на коренях і в ризосфері рослин. Були проведені досліди, в яких насіння рослин обробляли бактеріями, що мали генетичний маркер - стійкість до стрептоміцину (Str+). Виявилося, що кількість Str+ популяцій зростає впродовж вегетації рослин і набуває максимальних значень через 3-4 місяці після висіву інокульованого насіння у фунт. Таку закономірністьспостерігали щодо культурAzospirillum, Agrobacterium, Azotobacter.