9738_Metodichka_virusologiya

зору, обережно опускають тубус у краплю так, щоб фронтальна лінза (передня) не торкалася препарату і, повільно обертаючи макрогвинт до себе, піднімають тубус до появи в полі зору сфокусованого препарату. Зображення фокусують обертанням мікрогвинта, за допомогою якого одержують найбільшої чіткості та ясності зображення. Мікрогвинтом користуються протягом усього часу вивчення об’єкта. Забороняється опускати тубус, дивлячись в окуляр. Це може призвести до пошкодження лінзи або роздавлення предметного скла. Після закінчення роботи треба підняти тубус, зняти препарат й обережно витерти фронтальну лінзу спочатку фільтрувальним папером, а потім злегка змоченою у бензинічи ксилолі батистовою ганчіркою. Забороняється торкатись лінз пальцями.

ЕЛЕКТРОННА МІКРОСКОПІЯ

Для дослідження найтонших структур мікробних клітин, вірусів використовують електронні мікроскопи, за допомогою яких можна дістати зображення досліджуваних об’єктів у мільйон і більше разів.

Перший електронний мікроскоп складався з таких основних частин: а) електронної пушки (джерело електронів); б) електромагнітних котушок, які виконують роль конденсорної, об’єктивної і проекційної лінз; в) предметного столика, екрана для зображення; г) окуляра; д) вакуумного насоса, оскільки рух електронів можливий тільки у вакуумі (рис. 6).

В електронних мікроскопах світлові промені, замінює струмінь електронів, який при відповідних прискореннях має довжину хвилі майже в сто тисяч разів коротшу від довжини хвилі денного світла. Для біологічних досліджень широко застосовують просвічуючий (трансмісійний) електронний мікроскоп. Електрони в ньому рухаються так, як і промені світла в світловому мікроскопі. Крім трансмісійних, використовуються також скануючі (растрові) електронні мікроскопи, які дають об’ємне рельєфне зображення досліджуваного об’єкта.

Сучасні електронні мікроскопи приєднані до комп’ютерів (рис. 7).

Рис. 7. Сучасний електронний мікроскоп

При роботі з електронними мікроскопами необхідно суворо дотримуватися встановлених правил техніки безпеки.

ВИМІРЮВАННЯ МІКРОРГАНІЗМІВ.

Часто в процесі вивчення мікробів виникає потреба встановити їхні розміри. Вимірюють мікроорганізми під мікроскопом при наявності окуляр-мікрометра і об’єктмікрометра.

Контрольні питання

1.Особливості техніки безпеки при роботі у мікробіологічній лабораторії.

2.Які кімнати повинні бути у мікробіологічній лабораторії?

3.Умови, які повинні бути у мікробіологічній лабораторії?

4.Чим відрізняються сухі та імерсійні системи мікроскопа?

5.З яких основних частин складається простий світловий мікроскоп?

6.Назвіть правила та послідовність при користуванні мікроскопом.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 2

Тема: Стерилізація поживних середовищ, посуду та інструментів

Мета: Ознайомитисьзосновнимиметодами стерилізаціїсередовищ, посудута інструментів. Матеріали та обладнання: Хімічні реактиви – антисептики, які мають токсичні властивості

на мікроорганізми, вода водопровідна, автоклави, термошафа, сушильна шафа, плитка газова та електрична. Бактерицидні фільтри.

План

1.Стерилізація хімічна.

2.Стерилізація фізична.

3.Стерилізація механічна.

Стерилізація ― це повне знищення мікробів та їхніх спор у поживних середовищах, посуді, на інструментах тощо.

Предмет чи середовище вважаються стерильними, якщо на їх поверхні і всередині немає мікробів, їх спор, здатних до розмноження.

Серед методів стерилізації розрізнюють:

а) фізичний; б) хімічний; в) механічний.

Можливість і доцільність використання того чи іншому способу стерилізації визначається особливостями, фізичним і хімічним складом матеріалу, який необхідно стерилізувати, і методом дослідження.

1. ХІМІЧНА СТЕРИЛІЗАЦІЯ

Хімічний метод стерилізації ― оснований на використанні хімічних антисептичних речовин (антисептичні речовини ― це хімічні речовини, які токсично (згубно) діють на мікроби).

Під хімічною стерилізацією розуміють знезаражування матеріалів, предметів тощо за допомогою хімічних речовин:

1)етиловий спирт;

2)хлорне вапно;

3)хлороформ;

4)формалін;

5)мертіолат;

6)фенол;

7)хінозол;

8)йод.

У мікробіологічних лабораторіях найчастіше використовують розчин карболової кислоти (3―5%), лізолу (1―3%), формаліну (4%), хлораміну (1―5%), хлорного вапна (10―20%) та інші. Борну кислоту, гліцерин, фенол та деякі інші хімічні речовини часто використовують як консервантипривиготовленнілікувальнихідіагностичнихсироваток,вакцинтощо.

2. ФІЗИЧНА СТЕРИЛІЗАЦІЯ

Фізичний метод стерилізації ― оснований на дії високої температури і ультрафіолетового опромінювання.

У мікробіологічній практиці найчастіше застосовують стерилізацію за допомогою високої температури (так звана термічна стерилізація).

До методів фізичної стерилізації відноситься:

1.фламбування ― прожарювання на полум’ї;

2.стерилізація сухим жаром;

3.стерилізація кип’ятінням;

4.тиндалізація ― стерилізація текучою парою;

5.автоклавування;

6.пастеризація;

7.стерилізація ультрафіолетовими променями.

Фламбування ― прожарювання на полум’ї. Цей метод дає добрі результати при стерилізації невеличких за розмірами лабораторних інструментів. Обпалюванням або прожарюванням на полум’ї спиртівки стерилізують бактеріологічні петлі, препарувальні голки, ланцети,пінцети,предметнітанакривніскельця,скляніпалички,ножиці,шпателітощо.

Стерилізація сухим жаром. Чисті колби, чашки Петрі, пробірки, піпетки, різний скляний посуд, загорнутий в папір, стерилізують у спеціальній сушильній шафі при температурі 160―170 °С протягом 2 год. Стерильні предмети виймають з сушильної шафи, коли температура знизиться до кімнатної.

Стерилізація кип’ятінням. Шприци, голки, гумові предмети, хірургічні інструменти стерилізують кип’ятінням у спеціальних стерилізаторах протягом 30 хв. Для зменшення жорсткості води та підвищення температури кипіння у стерилізатори додають 1 ― 2 %-й розчин NaHCO3.

Стерилізація ультрафіолетовими променями. З цією метою використовують

бактерицидні лампи. Метод застосовується для стерилізації повітря в мікробіологічних лабораторіях, боксах, операційних, а також лабораторних столів, деяких предметів і матеріалів. Час опромінення ― 20 хв.

Тиндалізація. Цей метод застосовується для стерилізації речовин, що руйнуються або змінюють властивості при нагріванні (деякі поживні середовища, сироватки, вітаміни тощо). Запропонований англійським ученим Тиндалем. Тиндалізація проводять в автоклаві з відкритим паровідвідним краном або використовують апарат Коха (рис. 9). Тиндалізація проводиться при температурі 56 ― 58 °С по 30 хв. протягом 5 ― 6 днів поспіль, вбиває всі вегетативні клітини мікробів. У проміжках між стерилізацією створюються умови для проростання спор і їх подальшого знищення при наступному прогріванні.

Рис. 9. Апарат Коха

А ― зовнішній вигляд; Б ― внутрішня будова

Стерилізація текучою парою ― проводять три рази по 30―40 хв. в автоклаві з не загвинченою кришкою. У проміжках між обробкою парою середовище тримають при температурі 30 °С у термостаті протягом доби для пророщування спор.

Пастеризація. Метод, запропонований Луї Пастером, застосовується для знезараження харчових продуктів: молока, соків, пива, вина тощо. При цьому матеріал нагрівається при температурі 50―65°С протягом 15―30 хв. або при 70―80°С ― 5―10 хв.

Цей метод використовують для знищення неспороутворюючих мікроорганізмів. Він може проводитися в термостаті або на водяній бані.

Стерилізація парою під тиском ― автоклавування. Найбільш надійним способом стерилізації поживних середовищ, посуду і матеріалів є стерилізація парою під тиском в герметично закритому котлі-автоклаві (рис. 10).

Рис. 10. Автоклави:

А ― вертикальний АВ – 1; Б ― горизонтальний АГ – 1; В ― автоматичний АШ – 250

Автоклав вертикальний (АВ ― 1 і АВ ― 2) це металевий двостінний котел, здатний витримувати високий тиск.

При звичайному атмосферному тиску температура водяної пари дорівнює 100 °С. При підвищенні тиску пари температура її значно підвищується (табл.1). Спільна дія високої температури і тиску пари спричинюють швидку загибель не тільки вегетативних клітин мікробів, а й їхніх спор.

Таблиця 1

Співвідношення між температурою, тиском і часом стерилізації в автоклаві

Внутрішня частина котла-автоклава ― стерилізаційна камера (1). В ній є отвори, з’єднані з краном для виходу повіддя (2), з контрольним і контактним манометрами, що автоматично підтримують певний тиск, із запобіжним клапаном (4), який випускає надлишок пари, запобігаючи розриву автоклава. Між подвійними стінками котла є простір ― водопарова камера (5), яка заповнюється через воронку (6) водою. Для безпеки працюючих паровий котел ззовні закритий міцним металевим кожухом. Після закипання води водяна пара через отвір (7) потрапляє в стерилізаційну камеру, герметично закриту металевою кришкою, і створює підвищений тиск. Більшому тиску відповідає вища температура. Під час створення надлишкового тиску 0,5 атм понад атмосферний, температура в стерилізаційній

Рис. 11. Фільтр Зайтца приєднаний до насоса:

1 ― посудина з рідиною, що фільтрується;

2 ― Шамберлана;

3― гумова трубка;

4― водоструминний насос;

5― проміжна посудина

Підготовка матеріалів до стерилізації Посуд перед стерилізацією чисто миють і загортають у папір для збереження

стерильності після прогрівання. Широкий отвір піпеток закривають ватою, піпетки складають у паперові пакетики. Пробірки, колби, пляшки, призначені для культивування мікроорганізмів, закривають ватними корками, які захищають культури від зараження сторонньою мікрофлорою і від висихання. Через ватні корки відбувається також газообмін з оточуючим середовищем. Ватні корки готують із звичайної негігроскопічної вати. Для виготовлення корка беруть рівний кусок вати, загинають краї і скочують між долонею і чистим склом. Зручно корок обв’язати марлею. Корок на 2/3 повинен заходити в пробірку. Для захисту від пилу перед стерилізацією ватні корки накривають паперовими ковпачками. Не можна ці ковпачки робити з матеріалів, непроникних для пари, бо пара не потрапить до середини посудини і не простерилізує її вміст. Середовище, приготовлене для стерилізації, наливають у колби до половини, у пробірки ― на 1/2, 1/3 .

Мета роботи. Підготувати посуд і середовище до стерилізації, простерилізувати їх в автоклаві.

Дезинфекція ― це застосування хімічних речовин для знищення або пригнічення мікроорганізмів.

Значне число хімічних сполук в певних концентраціях здатні знищувати або пригнічувати мікроорганізми. Ці речовини широко застосовуються від дезинфекції ротової порожнини до космічного корабля. Немає єдиного хімічного антимікробного агента, який був би ідеальним у всіх випадках. Проте ці речовини повинні відповідати певним вимогам: мати антимікробну активність, бути розчинними у воді, нетоксичними для людини та тварин, бути гомогенними, не мати різкого запаху та ін.

Всі ці сполуки можна розподілити на такі групи:

1.фенол та його сполуки;

2.спирти (етиловий та ін.);

3.галогени (йод, хлор) та їх сполуки;

4.важкі метали (ртуть, мідь, срібло) та їх сполуки;

5.фарби анілінового ряду;

6.кислоти і луги;

7.газоподібні хемойерилізатори (окис етилену, формальдегід та ін.).

Слід розрізняти наступні терміни:

1)дезинфекція ― процес знищення інфекційних агентів;

2)бактерицид ― це агент, який убиває бактерії;

3)фугніциди (убивають гриби);

4)віруциди (убивають віруси);

5)спороциди (убивають спори).

3) санітизатори ― речовини, які знижують мікробну популяцію на 99,9%. Застосовуються на неживихоб’єктах.

Контрольні питання

1.Які є методи стерилізації?

2.Що таке хімічна стерилізація?

3.Які реактиви застосовуються при хімічній стерилізації?

4.Назвіть способи термічної стерилізації, з’ясуйте переваги і недоліки.

5.Принцип побудови автоклава.

6.В яких випадках використовують тиндалізацію, пастеризацію, дезинфекцію.

7.Що таке механічна стерилізація?

8.Які є бактеріологічні фільтри?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 3

Тема: Поживні середовища

Мета: Ознайомитись з методикою приготування поживних середовищ та вивчити їх класифікацію.

Матеріали та обладнання: Ваги електричні, автоклав, плитка газова або електрична, пробірки, піпетки, циліндри, пляшечки, колби, чашки Петрі, спиртівки хімічні реактиви, вода водопровідна.

План

1.Значення хімічних елементів для живлення мікроорганізмів.

2.Класифікація поживних середовищ

3.Приготування поживних середовищ.

1. ЗНАЧЕННЯ ХІМІЧНИХ ЕЛЕМЕНТІВ ДЛЯ ЖИВЛЕННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

Для нагромадження, вирощування, виділення і зберігання мікроорганізмів у лабораторних умовах використовують різні поживні середовища. Виготовляють такі середовища з продуктів рослинного і тваринного походження.

Для нормального росту і розвитку мікроорганізмів поживні середовища повинні містити всі необхідні елементи: макро- і мікроелементи, вітаміни, стимулятори росту тощо. Так як, до складу клітин мікроорганізмів входять органогенні (С, О, Н, N), зольні елементи (P, S, K, Mg, Ca, Fe) і мікроелементи, які в малих дозах стимулюють ріст клітинної маси, а у великій уповільнюють його. До нихвідносять Zn, Mn, B, Cu, Mo, Co та інші.

Вони також мусять мати певні фізико-хімічні властивості: рН середовища, вологість, температуру, осмотичні властивості, окисно-відновний потенціал. Крім цього, обов’язковою рисою поживних середовищ повинна бути стерильність.

2. КЛАСИФІКАЦІЯ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ І. За походженням (складом) поживні середовища бувають:

1.природні;

2.штучні:

-напівсинтетичні

-синтетичні.

Природні поживні середовища виготовляють з натуральних продуктів: молока, відвару м’яса, овочів, картоплі, пивне сусло, хліб тощо.

Штучні поживні середовища виготовляють або з хімічних речовин і натуральних продуктів.

Напівсинтетичні ― виготовляють з хімічних речовин і натуральних продуктів.

Синтетичні ― тільки з різних хімічних сполук.

ІІ. За призначенням розрізняють поживні середовища:

1.звичайні;

2.спеціальні; - елективні;

3.диференціально-діагностичні.

Звичайні середовища ― на яких вирощують більшість сапрофітних і патогенних мікробів, до них належать м’ясо-пептонний бульйон, (МПА) м’ясо-пептонний агар, м’ясопептонний желатин та інші.

Спеціальні середовища ― на яких вирощують ті види мікроорганізмів, які не ростуть на простих поживних середовищах (агар з кров’ю, агар із сироваткою, кров’яний телуритовий агар, жовткові середовища, середовище Омельянського, Чапека тощо). До спеціальних належатьтакож

іелективнісередовища Елективні середовища ― на яких створюються сприятливі умови для росту якого-небудь

одного видумікробів (бобовийагар, картоплянийагар,сіннанастоянкатаінші). Диференціально-діагностичні поживні середовища, які дають змогу швидко

відрізнити одні види мікроорганізмів від інших (напр., середовища Ендо для кишкової палички, середовище Штерна для сальмонел та ін.).

ІІІ. За консистенцією середовища бувають:

1.рідкі;

2.напіврідкі;

3.тверді;

4.сухі.

Рідкі поживні середовища готуються без загусників (агар-агар, желатин) доцільно використовувати для вивчення фізіолого-біохімічних особливостей, а також для нагромадження мікробної біомаси (або продуктів її обміну).

Тверді поживні середовища ― агаризовані пластинки, які найчастіше застосовують для виділення чистих культур, підрахунку кількості бактерій та інших діагностичних цілей. Тверді поживні середовища виготовляють з рідких, додаючи до останніх 1,5―2,5 %-го агарагару (виготовляється з морських водоростей) або 10―15 % желатину (суміш білкових речовин тваринного походження, отримується при виварюванні кісток та хрящів).

Напіврідкі поживні середовища готуються з додаванням 0,1 ― 0,2% агар-агару. Сухі поживні середовища випускаються у вигляді порошків (наприклад, сухий агар,

сухий поживний агар, сухий агар Ендо, середовище Плоскірєва тощо), і якщо їх правильно зберігати, то вони довгий час не втрачатимуть своїх властивостей. Використання таких середовищ в навчальних лабораторіях є доцільним, бо заощаджує час при підготовці лабораторних занять.

Поживні середовища повинні мати набір усіх необхідних поживних речовин, бути стерильними, прозорими і вологими; рН середовища: для грибів ―3―4; для бактерій ― 6,8―7,2; для актиноміцетів ― 8.

3. ПРИГОТУВАННЯ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ.

При приготуванні поживних середовищ реактиви вносять добре відмитими шпательками, або стерильними прожареними папірцями, а рідкі піпетками. Посуд повинен бути стерильним.

РЕЦЕПТИ ПРИГОТУВАННЯ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ.

М’ясо-пептонний бульйон. Для виготовлення найуживаніших поживних середовищ ― м’ясо-пептонного бульйону (МПБ), м’ясо-пептонного агару (МПА), м’ясо-пептонного желатину (МПЖ) та інших ― насамперед треба приготувати м’ясну воду, оскільки вона є основою всіх цих середовищ. Пептон ― це суміш поліпептидів, яка одержана шляхом ферментації гідролізу м’яса. З цією метою свіжу телятину або яловичину звільняють від жиру, сухожилків, фасцій і пропускають через м’ясорубку. До 0,5 кг фаршу додають у два рази більше води, розмішують і настоюють протягом 2 год при температурі 37―39 °С. Одержаний настій проціджують через марлю і кип’ятять 20 хв до зсідання білків. Потім його фільтрують через вату або паперовий фільтр і стерилізують в автоклаві протягом 30 хв при температурі 120 °С і тискові 1 атм.

До 1 л м’ясної води додають 5 г кухонної солі, 10 г пептону і кип’ятять до повного розчинення пептону. Додають насичений розчин бікарбонату натрію до слабколужної реакції

ізнову піддають кип’ятінню протягом 20 хв. Потім доливають водою до початкового об’єму

іфільтрують, розливають в колби і пробірки та стерилізують протягом 20 хв в автоклаві при температурі 120 °С. Готовий бульйон повинен бути прозорим і мати янтарно-жовтий колір. Для скорочення часу це середовище часто виготовляють із готових бульйонних кубиків.

М’ясо-пептонний агар виготовляють із м’ясо-пептонного бульйону, додаючи 2―2,5