9738_Metodichka_virusologiya

Гідролази — ферменти, які прискорюють реакцію гідролізу, розщеплення складних органічних сполук. З їх дією пов’язано перехід високомолекулярних органічних речовин в доступні рослинам імікроорганізмам сполуки.

Дегідрогеназа — каталізує відщеплення водню органічних речовин при їх окисленні в ґрунті.

Уреаза — фермент каталізує гідроліз сечовини до аміаку і вуглекислоти. Хоча сама мочевина частково поглинається рослинами, однак в результаті активної дії уреаз вона не може довго зберігатися в ґрунті.

Свіжа органічна речовина (рештки, добрива), що надходить у верхній шар ґрунту дуже заселяється мікроорганізмами і збагачується ферментами, які сприяють мобілізації цукрів, крохмалю, органічних кислот, амідів і фенольних сполук.

Разом з рослинними рештками надходять у ґрунт збережені в них ферменти, а також ферменти епіфітної мікрофлори. Тому активність в шарі 0—10 см слід розглядати як сумарну величину — результат сумісної дії ферментів мікроорганізмів і рослин. У шарі 10—20 см активність в основному зумовлена діяльністю грибів, бактерій, безхребетних. В цьому шарі проходить інтенсивний розклад целюлози, лігніна, а також органічних сполук, синтезованих мікрофлорою і фауною.

ІІІ. ЦЕЛЮЛОЗОРУЙНІВНА АКТИВНІСТЬ ҐРУНТУ.

Целюлозолітична активність ґрунту — активність процесу деструкції у ґрунті біополімеру клітковини (С6Н10О5)n.

Клітковина — найбільш поширена органічна речовина в природі. До її складу входить понад 50% органічного вуглецю біосфери. За хімічною природою клітковина являє собою полісахарид, молекула якого складається із залишків глюкози (від 300 до 3000), з’єднаних між собою 1,4 — зв’язками. Це лінійний високополімерний гомополісахарид. Розклад целюлози відіграє важливу роль, оскільки цей процес забезпечує повернення основної маси СО2, необхідного для фотосинтезу, в атмосферу.

Наймасштабніший деструкційний процес, що протікає у ґрунтовому середовищі і пов’язаний з кругообігом вуглецю в природі — це розклад клітковини. Саме клітковина виступає основним джерелом енергії для всього життя ґрунту взагалі.

Процес розкладу клітковини протікає безперервно, тобто піддається біологічній трансформації за участю ґрунтової мікробіоти, оскільки полісахарид клітковина або целюлоза (С6Н10О5)n дуже стійкий до дії хімічних сполук.

Клітковину розкладають аеробні мікроорганізми (бактерії, актиноміцети, гриби) та анаеробні бактерії.

При аеробному розкладі глюкоза перетворюється до СО2 іН2О. При анаеробномувона піддається процесу бродіння, в результаті якого утворюються чимало органічних речовин (кислоти, спирти тощо).

Аеробний розклад. Цей процес здійснюють бактерії родів Суtорhаgа, Sроrосуtорhаgа,

Роlуаngіum, Аrсhаngium, Sроrаngium, Мухоcоссus, Сеllulоmоnаs.

До актиноміцетів і грибів, що розкладають целюлозу в ґрунтах, належать представники родів Strерtоmусеs, Strеtоsроrаngіum, Місrоmоnоsроrа, Аsреrgіllus, Воtrуtis, Dеmаtіum, Fusаrіum, Реnісillum, Rhizoсtоnіа, Тrісhоdеrmа та інші.

Анаеробний розклад здійснюють переважно бактерії роду Сlоstrіdіum. Розклад клітковинивідбувається протягом кількох етапів.

Перший етап — ферментативний гідроліз складного полісахариду під впливом ферменту целюлази, який розщеплює β 1,4-глікозидні зв’язки. При цьому полімерний ланцюг молекули клітковини перетворюється спочатку на дисахарид целобіозу.

Другий етап — під дією ферменту глюкозидази (целобіази) гідролізується до глюкози:

(С6Н10О5)n+Н2О→nСІ2Н22О11+Н2О→nС6Н12О6.

Відмічена диференціація показників активності процесу розкладу клітковини залежно від виду органічних речовин. Целюлозолітична активність на чорноземі опідзоленому при тривалому удобренні ґрунту гноєм зростала на 17,4%, при сумісному заорюванні сидерату і

соломи — на 33,4%, а при поєднанні гною з сидератом і соломою — на 56,4%. Використання добрив, особливо органічних, сприяє підвищенню потенціальної целюлозолітичної активності ґрунтів.

І V. ФІТОТОКСИЧНІСТЬ ҐРУНТУ

Фітотоксичність — здатність деяких груп хімічних сполук і продуктів метаболізму мікроорганізмів здійснювати негативний вплив на рослинні організми, що проявляється у порушенні багатьох фізіологічних процесів.

Нераціональне і науково-необгрунтоване застосування різних агротехнологій призводить до зміни екологічного стану ґрунтового середовища, що в веде до перебудови мікробного ценозу і викликає розмноження токсинсинтезуючих мікроорганізмів, накопичення токсичних продуктів фенольного ряду, які утворюються в процесі розкладу рослинних решток. накопичення фітотоксичних форм мікроорганізмів.

Хід роботи. Метод Ю.М. Мочалова і Н.К. Шерстобоєва.

Для визначення токсичності ґрунту потрібно перезволожити досліджуваний зразок до сметаноподібного стану і розподілити його в чашки Петрі, рівненько шпателем. Потім на ґрунтову пластинку наноситься шар сухого стерильного піску, товщиною 0,4—0,6 см, попередньо промитого у воді. Ґрунтова пластинка с піском компостується 24 год при кімнатній температурі для дифундуания фітотоксинів в пісок. Вологість досліджуваного зразка ґрунту с піском перед посівом насіння повинна бути в межах 70—80% від повної вологоємкості. У всіх досліджуваних зразках вага ґрунту в чашках Петрі, а також шар нанесеного піску, повинні бути однаковими. Контролем служить стерильний пісок, зволожений до 70-80% від повної вологоємкості. Посів насіння проводиться в пісок шляхом вдавлювання їх на половину їх товщини. Пророщують насіння тест культури редису (Рарhanus sativum L.), сорт красний с білим кінчиком при 25—28оС. Облік пророслого насіння ведеться на третю добу. По різності схожості насіння на контролі і досліджуваному зразку судять о степінь токсичності ґрунту.

Приклад разрахунку токсичності ґрунту. Зійшло насіння на контролі 85% (85 насіння із 100), що приймається за 100%, а схожість на досліджуваному варіанті– за Х.

Токсичність ґрунту чи процент інгібування схожості рівний 100-25=75%. (інгібування

— придушення росту).

Контрольні питання

1.Що таке біологічна активність ґрунту?

2.Що таке ферментативна активність ґрунту? Які ферменти виділяються мікроорганізмами, їх дія?

3.Що таке целюлозо руйнівна активність ґрунту, хто її спричиняє?

4.Що таке фітотоксичність ґрунту, як її визначити?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 15

Тема: Мікрофлора кормів

Мета: Вивчити особливості епіфітних мікроорганізмів та методи їх виділення. Вивчити основи процесів силосування кормів

Матеріали та обладнання: 1) чашки Петрі, 2) середовище МПА, 3) листок з досліджуваної рослини, 4) термостаті, 5) пляшечки, 6) піпетки, 7) пробірки зі стерильною водою, 8) колби, 9) пісок, 10), водопровідна вода, 11) мікроскоп, 12) силос.

План

1.Епіфітна мікрофлора зерна.

2.Мікробіологічний аналіз силосу.

І. ЕПІФІТНА МІКРОФЛОРА ЗЕРНА

Велика кількість мікроорганізмів міститься на надземних органах рослин: стеблах, листках, квітках, плодах і насінні. Вперше це було виявлено Р. Буррі ще в 1903 р. Мікроби, що живуть на поверхні рослини, дістали назву епіфітів, або мікроорганізмів філосфери.

Переважну більшість епіфітів складають гнильні бактерії Erwina herbicola, Pseudomonds fluorescens, а також мікрококи, молочнокислі бактерії і дріжджі та ін. Трапляється незначна кількість бацил, актиноміцетів та мікроскопічних грибів, а також і представники фітопатогенної мікрофлори.

Епіфітні мікроорганізми живляться нормальними виділеннями рослинних тканин. Основними поживними речовинами для них є амінокислоти, моно- і дицукри, вітаміни, мінеральні елементи тощо. Для живлення представників епіфітної мікрофлори чимале значення має летка фракція органічних сполук, які виділяють рослини. Епіфіти є стійкими до високих концентрацій фітонцидів.

Для рослин епіфітні мікроорганізми можуть бути як корисними, так і шкідливими. Інтенсивне розмноження їх може створювати своєрідний біологічний бар’єр, який перешкоджає проникненню паразитів у рослинні тканини. Проте, при зберіганні зерна з підвищеним вмістом вологи ці мікроорганізми часто можуть негативно впливати на нього.

Хід роботи: І. Найпростішим методом виявлення епіфітної мікрофлори є метод відбитків. У стерильні чашки Петрі заливають розплавлений простерилізований МПА. Після утворення агарових пластинок листок з досліджуваної рослини щільно притискують до поживного середовища. Для інкубації мікробів чашки Петрі розміщують у термостаті при температурі 25—37 °С на 2—3 доби. По закінченні інкубації проводять кількісний облік і вивчення характеристики колоній мікроорганізмів.

Хід роботи: ІІ. Кількісний облік мікроорганізмів на зерні. Наважку зерна в 5 г вміщують у колбу з 50 мл стерильної питної води, сюди ж додають 3 г піску. Суміш у колбі збовтують протягом 10 хв. Із одержаної витяжки виготовляють серію розведень (10-2, 10-3, 10-4). З готових розведень стерильними піпетками відбирають по 10 мл суспензії і переносять у колби з 90 мл стерильної водогінної води. Після цього відбирають з кожної колби по 1 мл суспензії і виливають у стерильні чашки Петрі, сюди ж заливають по 20 мл попередньо розплавленого і охолодженого до 50 °С МПА. Для інкубації чашки ставлять у термостат при температурі 30 °С. Крім МПА, можна також використовувати такі елективні середовища, як сусло-агар з крейдою, капустяний агар з крейдою, лептонний агар, картопляне середовище з крейдою та інші.

Через 2—5 днів інкубації проводять облік загальної кількості колоній, які виросли на поживному середовищі в чашках, і перераховують кількість мікроорганізмів на 1 г зерна.

Для визначення якісного складу епіфітної мікрофлори, колонії згруповують за культуральними ознаками, і з кожної групи колоній виготовляють мікропрепарати, виявляють належність мікробів до роду або родини та визначають кількість бактерій кожної

групи в процентах від загальної кількості мікроорганізмів.

На свіжому доброякісному зерні переважають Erwina herbicola, які утворюють блискучі оранжеві колонії. Набагато менше утворюється жовтувато-зеленуватих флуоресцюючих колоній Pseudomonas fluorescens та блискучих опуклих (часто з рожевим відтінком) дріжджових колоній. На несвіжому зерні, яке зберігалося при підвищеній вологості, Erwina herbicola і Pseudomonas fluorescens майже не виявляються. Найчастіше трапляються мікрококи, які утворюють дрібненькі білі плескаті колонії, спорові бактерії, актиноміцети і мікроскопічні гриби.

ІІ. МІКРОБІОЛОГІЧНИЙ АНАЛІЗ СИЛОСУ.

Скошені рослини можна зберігати шляхом висушування або силосування. Мікрофлора кормів спричинена умовами їх зберігання чи консервування (силосування) – температурою, вологістю середовища та видовим складом рослин. Головним у процесі силосування є молочнокисле бродіння викликане молочнокислими бактеріями. При неправильній закладці рослинної маси на силосування у кормах можуть розвиватись плісняві гриби, гниль і маслянокислі бактерії та інші небажані мікроорганізми. Такі корми часто спричиняють отруєння, розлад органів травлення тварин. Вчасний аналіз корму може допомогти виявити причину псування корму, усунути їх. Основним із таких аналізів є мікробіологічний аналіз.

Органолептична оцінка силосу.

Колір повинен бути близький до кольору рослин. Зіпсований силос коричневого кольору.

Запах силосу приємний нагадує хлібний квас або запах квашених яблук чи овочів. При псуванні силосу з’являється запах оцту, редьки, оселедця — це запах зіпсованого маслянокислим бродінням.

Смак силосу слабо-кислий, а зіпсованого — неприємний, кислий, гіркуватий. Консистенція силосу така ж, як і у рослинної маси, а при псуванні силосу листки

напіврозкладені, маса ослизла, мажеться.

Оцінка силосу. рН силосу визначають колориметрично, електрометрично, або лакмусовим папером (стандартна шкала).

Якість силосу визначають за табл. А.Н. Міхіна.

Дані бальної оцінки підсумовують: 11—12 дуже якісний; 9—10 хороший; 7—8 середньої якості; 4—6 поганий. Силос що має оцінку 3 і нижче зіпсований.

Визначення мікрофлори силосу: Проби силосу на мікробіологічний аналіз потрібно брати у три строки: підчас закладання; через 10—15 днів після закладки; у момент розкривання. В башті беруть 3 проби: першу і другу на відстані 1 м від поверхні та низу. В траншеях беруть 2—3 проби (залежно від довжини) на глибині 1 м від поверхні. В круглих ямах після зняття верхнього шару в центрі і на глибині1 м. У надземних буртах можна брати одну пробу після зняття верхнього шару. Пробу беруть у стерильну посудину.

У стерильній фарфоровій ступці з стерильною водою розтирають шматочок силосу. Роблять препарат фіксують і забарвлюють еритрозином мікроскопують під імерсією. В якісному силосі зустрічаються стрептококи, монококи та палички, у зіпсованому – багато коків (стрептокои, сарцини, стафілококи) та палички, при детальному мікроскопуванні виявляють молочнокислі, маслянокислі, гнильні, дріжджі та плісняві гриби.

Хід роботи:

Перед посівом готують розведення. Зважують 40 г силосної маси. Переносять її у стерильний посуд І з 360 мл стерильної води. Збовтують 10 хв. Це розведення 1 : 10. Витяжку 10 мл з колби І переносять в колбу ІІ з 90 мл стерильної води(це розведення 1 : 100), збовтують 3 хв. З колби ІІ 10 мл в колбуІІ і т. д.

Фізіологічні групи мікроорганізмів визначають на поживних середовищах: МПА — мясо-пептонокий агар — мікроорганізми, які використовують органічні форми азоту; СА — сусло-агар — дріжджі та плісняві гриби; молоко — молочнокислі бактерії; лактоза — газоутворюючі (кишкові) бактерії; картопляне середовище Рушмана — маслянокислі бацили.

Після охолодження середовища до t 45—50оС, до тієї пори коли до посуд з середовищем можна прикласти до лиця і не обпектись. Вносять у підготовлені чашки Петрі: стерильні підписані, 1 мл розведення І, ІІ, ІІІ, ІV, V, VI, VII. Добавляють до суспензії середовище та легким круговим рухом перемішують і залишають на рівній поверхні до застигання. Потім перевертають чашки Петрі догори дном і ставлять у термостат при 27—32 оС на 3 доби. Кількість мікроорганізмів на щільних поживних середовищах визначають звичайним способом, а на молоці— за його згортанням.

Розвиток мікробіологічних процесів при силосуванні.

Перша фаза. Переважають амоніфікатори, плісняві гриби та дріжджі. При правильному силосуванні ця мікрофлора через 1—2 дні пригнічується продуктами молочнокислих бактерій.

Друга фаза. Відбувається при домінуванні молочнокислих бактерій спочатку стрептококів Streptococcus, а потім паличкоподібних Lactobacillus.

Третя фаза. Відрізняється від перших двох перевагою молочнокислих паличок. Кінцева величина рН у цій фазі досягає 4,0—4,2. Кількість молочної кислоти у доброякісному силосі становить 1,5—2% маси корму, а рН корму не повинна перевищувати

4,2.

Показники водневих рН, при якому можуть розвиватись мікроорганізми у силосі:

-молочнокислі стрептококи 4—8;

-молочнокислі палички 3—7;

-маслянокислі бактерії 4,7—8,5;

-гнильні 5—9;

-дріжджі 4,6—8;

-плісняві гриби 1,5—7,0.

Контрольні питання

1.Що таке філосфера і епіфіти?

2.Які є методи виділення мікрофлори зерна?

3.Які основні характеристики силосу? Назвати фази при приготуванні силосу.

4.Як здійснюється виділення мікрофлори силосу?

Список літератури

1. Асонов Н.Р. Практикум по микробиологии. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.:

Агропромиздат, 1988. – 155 с.

2.Большой практикум по микробиологии /Под ред. Селебер Г.Л. – М.: Высшая школа, 1962. – 492 с.

3.Векірчик К.М. Мікробіологія з основами вірусології: Підручник. – К.: Вища школа, 1987. – 232 с.

4.Векірчик К.М. Практикум з мікробіології. – К.: Либідь, 2001 – 143 с.

5.Груздь С.П. Практикум з мікробіології. – Львів: Львів нац. ун-т. І. Франка, 2003.–78с.

6.Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева Изд. 2-е,

перепаб. и доп. – М.: И-ва московского универсистета 1991. – 296 с.

7. Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж.

Сейли, С. Уилльямса 9-е издание М.: - Мир - 1997. - Т. 1. – 430 с.

8.Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. – 3-е

изд., перераб. и доп. – М.: Агропромиздат, 1987. – 239 с.

9.Чайка В.Є. Практикум з мікробіології. – Вінниця: Книга-Вега, 2004. – 92 с.

10.Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. – М.: Мир, 1987. – 567 с.

Для нотаток

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

ЗМІСТ

Вступ..................................................................

Лабораторна робота 1. Мікробіологічна лабораторія та мікроскопія.

Лабораторна робота 2. Стерилізація поживних середовищ, посуду та інструментів.

Лабораторна робота 3. Поживні середовища.

Лабораторна робота 4. Культивування, посів, зберігання і препарати мікроорганізмів.

Лабораторна робота 5. Морфологія мікроорганізмів.

Лабораторна робота 6. Облік чисельності мікроорганізмів ґрунту.

Лабораторна робота 7. Облік чисельності мікроорганізмів повітря.

Лабораторна робота 8. Облік чисельності мікроорганізмів води.

Лабораторна робота 9. Ідентифікація мікроорганізмів.

Лабораторна робота 10. Перетворення мікроорганізмами безазотистих органічних сполук.

Лабораторна робота 11. Перетворення мікроорганізмами азоту і його сполук.

Лабораторна робота 12. Біологічні добрива.

Лабораторна робота 13. Біологічні препарати для захисту рослин.

Лабораторна робота 14. Біологічна активність ґрунту.

Лабораторна робота 15. Мікрофлора кормів.

Список літератури