15. Проточная цитометрия

Принцип метода.

Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации флюоресценции и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии. Суспензия клеток под давлением подается в проточную ячейку, где за счет разности давлений между образцом и обтекающей жидкостью клетки, находясь в ламинарном потоке жидкости, выстраиваются в цепочку друг за другом (т.н. гидродинамическое фокусирование).

Клетки одна за другой проходят через лазерный луч, а высокочувствительные детекторы, расположенные вокруг проточной ячейки регистрируют флюоресценцию и рассеяное лазерное излучение каждой клетки. Полученный сигнал передается в компьютер, обрабатывается, и полученные данные отображаются в виде различных графиков и гистограмм.

Параметры, клеток регистрируемые при помощи проточного цитометра.

Прямое (малоугловое) светорассеяние - forward scatter. Детектор прямого светорассеяния располагается по ходу лазерного луча за проточной ячейкой и регистрирует излучение разера, которое рассеивается под углами 2-19 градусов. Интенсивность рассеянного под малым углом света пропорциональна размеру клетки. Более крупные клетки рассеивают свет сильнее мелких.

Боковое светорассеяние - side scatter. Внутреннее содержимое клеток оптически неоднородно. Луч лазера, проходя сквозь клетку, многократно преломляется и рассеивается во все стороны. Регистрация этого излучения позволяет судить о сложности внутреннего строения клетки (соотношение ядро-цитоплазма, наличие гранул, других внутриклеточных включений). Комбинация бокового и прямого светорассеяния позволяет судить о морфологии клетки в целом, выделять различные популяции клеток (лимфоциты, моноциты, гранулоциты) для дальнейшего анализа.

Регистрация флуоресценции. Система для регистрации свечения флюоресцентных меток состоит из комплекса светофильтров и фотоумножителей, каждый из которых регистрирует излучение в диапазоне длин волн, соответствующих флуорохрому. Выбор типа и количества флуоресцентных красителей определяется поставленной зачачей для данного исследования. Основными типами таких красителей являются моноклональные антитела, коньюгированные с флюоресцентной меткой (FITC, PE, APC, PerCP и др.) для определения мембранных и цитоплазматических антигенов клетки, красители, позволяющие оценить жизнеспособность клеток (7AAD, PI)флуорофоры, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами (DAPI, Hoechst), pH-чувствительные флуорофоры (Fluo-3), ион-зависимые флуорофоры (Indo-1).

Полученные данные обрабатываются компьютером и отображаются в виде одномерных гистограмм или двух- и трехмерных точечных или плотностных графиков. Анализ данных позволяет определить количество клеток, отвечающих тем или иным условиям, оценить интенсивность флуоресценции (т.е. плотность того или иного маркера на поверхности клетки). В некоторых случаях при помощи проточного цитометра можно определить абсолютное число клеток в исследуемом образце.

Сортировка клеток. В проточном цитометре, оборудованном системой для сортировке клеток, проточная ячейка закреплена на пьезокристалле. При подаче на него напряжения кристалл вместе с ячейкой совершает колебания с заданой частотой, в результате чего струя жидкости с клетками разбивается на отдельные капли. Проходя сквозь заряжающее кольцо, капля может приобретать положительный или отрицательный заряд в зависимости от того, какая клетка содержиться внутри капли. Пролетая мимо отклоняющих пластин капля с клеткой притягивается к ним, выходит из основного потока и попадает в пробирку.

Преимуществами сортировки клеток на проточном цитометре является высокая чистота получаемой популяции клеток (до 99.9% позитивных клеток в отсортированной фракции), возможность сортировать клетки по любым комбинациям детектируемых параметров. Данный метод позволяет отсортировывать любое количество клеток, вплоть до единичных клеток, что является незаменимым в технологиях связанных с клонированием. Проходя через системы прибора клетки подвергаются некоторым неблагоприятным воздействиям (лазерное излучение, перепады давления) что несколько снижает процент жизнеспособных клеток на выходе по сравнению с исходнам материалом. Также при сортировке на проточном цитометре бывает затруднительным соблюдение абсолютной стерильности, что ограничивает применение данного метода в клинической практике.

Некоторые, термины, часто использующиеся в проточной цитометрии.

Компенсация. Настройка прибора для исключения паразитного свечения флюорохрома в соседних каналах. Характеристики установленных на проточном цитометре светофильтров таковы, что их область пропускания соответствует максимуму спектра испускания флуорофора. Но за счет того, что спектр испускания флуорофора может быть достаточно широким, часть его излучения может проходить сквозь другие светофильтры, настроенные на регистрацию излучения дрогого флуорофора. То есть к примеру некоторая доля излучения от красителя FITC будет регистрироваться в канале, предназначенном для фикоэритрина, искажая результаты измерения. Для исключения данного эффетка необходимо уменьшать сигнал с детектора пропорционально сигналу с соседнего детектора, компенсируя таким образом паразитное свечение соседних флуорохромов. Величина компенсации зависит от многих параметров: напряжения на фотоумножителе и как следствие его чувствительности, спектра используемых флуорохромов, производителя реактивов (меченые антитела от разных производителей имеют разное соотношение белок/флуорофора, соответственно одни и те же образцы окрашенные различными антителами будет давать сигналы разной интенсивности).

Дискриминатор. Функция, благодаря которой не регистрируются события, не удовлетворяюшие какому-либо условию. Чаще всего данная функция используется для того чтобы не реристрировать объекты имеющие маленький размел, то есть исключить из анализа частицы разрушенных клеток, тромбоциты, другие мелкие посторонние объекты. Благодаря использованию дискриминатора уменьшается нагрузка на компьютер прибора, повышается его быстродействие, уменьшается размер записываемых файлов, что облегчает последующий анализ данных. Дискриминатор должен быт настроен таким образом, чтобы отсекать большую часть дебриса, но при этом не захватывать область, содержащую интересующие исследователя события.

Пробоподготовка образцов. В качестве образцов для исследования на проточном цитометре могут использоваться различные суспензии клеток и биологические жидкости. Для проведения исследования на проточном цитометре необходимо минимизировать количество частиц в исследуемой суспензии, которые могут затруднить анализ. Чаще всего такими частицами являются эритроциты в образцах крови или костного мозга, тогда как объектом исследования выступают лейкоциты. Получение лейкоцитарной суспензии возможно несколькими способами. Во первых можно лизировать эритроциты каким-либо химическим агентом, разрушающим мембрану эритроцита (наиболее распространенным является 0,9% раствор хлорида аммония). Вторым расространенным способом получения лейкоцирарной суспензии является центрифурирование в градиенте плотности (например выделение мононуклеарной фракции из крови при помощи центрифугирования на фиколле). Оба способа имеют свои достоинства и недостатки. Центрифугирование в градиенте плотности не позволяет работать с малыми объемами образцов, но зато в наимешьшей степени влияет на жизнеспособность и функциональную активность клеток. Также при данном способе выделения возможны потери достаточно большого количества клеток из исходного образца. Лизис эритроцитов может быть осуществлен в любом при любых количествах исходного биологического материала, минимизирует риск потери интересующих клеток, проще, дешевле и быстрее в постановке, однако данный метод является более травматичным для клеток и может оказать негативное влияние на их жизнеспособность и морфологические характеристики (клетки могут изменяться в объеме, возможно слущивание с поверхности клеток некоторых антигенов). В случае если требуется сохранение жизнеспособности и функциональной активности клеток следует выбрать выделение в градиенте плотности. Если же требуется произвести большое количество однотипных исследований в которых не выдвигается жестких требований к сохранению функциональной активности клеток следует воспользоваться лизирующим раствором. В том случае, когда объектом исследования является не биологическая жидксть, а культура клеток данный этап пробоподготовки как правило пропускается. Для контроля потери клеток рекомендуется параллельно с исследованием на проточном цитометре производить подсчет лейкоцитарной формулы под миероскопом, особенно это актуально при выделении клеток в градиенте плотности. При некоторых патологических состояниях морфология клеток крови может значительно изменяться, что приводит к значительным потерям при выделении в градиенте плотности и неверным результатам исследований.

Неспецифическое связывание антител. На точечной диаграмме неспецифическое связывание выглядит в виде “хвоста”, тянущегося от двойной негативной популяции под углом 45 градусов в верхний правый угол. Неспецифической связывание характерно для образцов с большим содержанием погибших клеток, а также для клеток, имеющих на поверхности Fc-рецептор (в основном, клетки, способные к фагоцитозу). Для борьбы с данным феноменом следует перед окрашиванием антителами обрабатывать клетки специальными реагентами для блокировки Fc-рецептора, проводить подготовку образцов таким образом, чтобы минимизировать гибель и разрушение клеток в процессе пробоподготовки. Также при анализе полученных данных нужно стараться чтобы в регион анализа попадало как можно меньше погибших клеток и дебриса.

Логическое гейтирование. Основной метод анализа цитометрических данных заключается в выделении какой-либо популяции клеток, и дальнейшего анализа событий,относящихся только к интересующей популяции. Гейтирование может производиться по любым регистрируемым параметрам и с использованием любых логических операторов и их комбинаций (И, ИЛИ, НЕ).На представленном примере сперва производится гейтирование по CD45 позитивным событиям выделение лейкоцитарной популяции и отсев дебриса. Следующим шагом идет выделение лимфоцитарной популяции по параметрам прямого и бокового светорассеяния. И уже после двойного гейтирования по CD45 и лимфоцитарному региону происходит заключительный этап анализа - определение процентного содержания субпопуляций лимфоцитов.

16. Аллерги́я (др.-греч. ἄλλος — другой, иной, чужой + ἔργον — воздействие) — сверхчувствительность иммунной системы организма при повторных воздействиях аллергена на ранее сенсибилизированный этим аллергеном организм.

Симптомы: резь в глазах, отёки, насморк, крапивница, чихание, кашель и пр. Иммунология сенсибилизации и десенсибилизации

Факторы сенсибилизации. Сенсибилизация организма, обусловленная реагинами, происходит в результате контакта с антигеном. В период внутриутробного развития пассивная сенсибилизация исключена, так как реагины не проходят через плаценту. Поэтому при рождении дети, как правило, еще не сенсибилизированы. После рождения ребенка возникает опасность контакта с аллергеном через материнское молоко, ингаляцию и т. д. Возможность сенсибилизации усиливается, если аллерген распространен в данном географическом районе. Подтверждением этого наблюдения служат исследования Grove: положительная реакция была обнаружена у одного из 36 больных поллинозами, которые были тестированы экстрактом аллергена амброзии, служащей основной причиной этого заболевания в США.

Другой фактор сенсибилизации - «агрессивность» аллергена. Это свойство аллергена вызывать преимущественную сенсибилизацию при контакте с несколькими аллергенами. Показателем служит максимальный процент лиц, сенсибилизированных этим аллергеном. В известном смысле «агрессивность» аллергена - это мера его способности вызывать эффект Т-хелперов.

Определенное значение имеют также такие факторы, как продолжительность экспозиции, характер поглощения аллергена, продолжительность и устойчивость сенсибилизации.

Иммунология десенсибилизации. Самые ранние опыты по изучению эффекта десенсибилизации были основаны на предположении, что путем введения в организм аллергена можно вызвать потребление реагинов. Это представление получило известность главным образом после опытов Безредки по антианафилаксии, однако уже в скором времени по этому поводу были высказаны сомнения. Детальные исследования показали, что даже аппликация антигена в дозе, которая может вызвать общую реакцию, не приводит к значительным изменениям уровня реагинов. Было вычислено то количество реагинов, которое содержится в 1 мл сыворотки при явных признаках общей атопической реакции. Представление о том, что антитела связываются антигеном, было признано несостоятельным. Следует считать маловероятной и теорию, согласно которой десенсибилизация - это результат действия неспецифических механизмов, будь то активация системы гипофиза и надпочечников или обычная продукция медиаторов аллергической реакции. Важным аргументом против такого представления служит факт, что успешная десенсибилизация одним аллергеном не влияет на способность реагировать с другими. Тем не менее исследователи вновь обратились к обсуждению этих вопросов. Наблюдения свидетельствуют о том, что десенсибилизация приводит к изменению свойств базофилов и тучных клеток. Это в свою очередь влияет или на процесс связывания IgE, или на результаты биохимических процессов реакции антиген-антитело.

Титр IgE-антител. Десенсибилизация больных атопией вызывает в первые месяцы после лечения 2-4-кратное повышение уровня реагинов. Лишь продолжительная десенсибилизация (в течение 2 лет) может привести к его постепенному снижению. Полностью реагины могут исчезнуть спустя 5-10 лет. Предполагаемые механизмы снижения титров IgE:

- участие блокирующих антител;

- состояние иммунологической толерантности путем активации антигеноспецифических клеток-супрессоров.

Блокирующие антитела. В 1935 г. Cooke и соавт. на основании результатов собственных исследований пришли к заключению, что эффект нейтрализации обеспечивается блокирующими антителами. Их можно обнаружить спустя несколько недель после введения антигена, примерно через 12 месяцев они достигают максимального уровня. Свое название антитела получили в связи с тем, что путем связывания с антигеном они блокируют его реакцию с реагином. С помощью иммуносорбентного метода было показано, что их способность к взаимодействию с аллергеном значительно выше, чем у реагинов. Этим и объясняется их блокирующий эффект. Данные антитела могут вырабатываться у больных, не страдающих атопией. В низких титрах их обнаруживают у нелеченых больных атопией. При лечении (десенсибилизация) уровень антител может повышаться в 20-40 раз. В отдельных случаях были получены положительные результаты переноса гипериммунных сывороток от здоровых лиц больным атопией. Представление о защитных свойствах блокирующих антител не лишено противоречий. Некоторые авторы указывают на повышение концентрации аллергеноспецифических антител IgA и IgG в секретах слизистой оболочки. Воздействие блокирующих антител может проявляться на разных стадиях иммунного ответа:

- афферентная блокада (снижение дальнейшего booster-эффекта) ;

- блокада центрального звена (инактивация IgE-клеток через иммунные комплексы или сходные механизмы);

- эфферентная блокада (конкуренция антител относительно антигена).

Структура антител еще не изучена. Предварительные данные о том, что они относятся к IgG4-субклассу, еще не подтверждены.

Работа De Week продолжила исследования, посвященные эффекту блокирующих антител, В результате повторной сенсибилизации у экспериментальных животных вырабатывались антиидиотипические антитела, которые в соответствии с принципом отрицательной обратной связи блокировали продукцию первичных антител. С помощью пассивного переноса этих антиидиотипических антител у несенсибилизированных животных удалось вызвать состояние толерантности, а у сенсибилизированных - снижение титра антител.

Функция лимфоцитов. Уровень иммунного ответа при антигенной стимуляции может существенно варьировать. Тем не менее следует отметить общие закономерности: тенденцию к нормализации ранее повышенного уровня, а также корреляцию между этим эффектом и дозой антигена.

Как правило, отмечают лишь частичную корреляцию между лабораторными данными и клиническим статусом больного.

Методы доказательства эффекта сенсибилизации. Тесты in vivo.

1. Прямой тест нейтрализации. При этом простом методе проводят инкубацию исследуемой сыворотки, инактивированной нагреванием (инактивация содержащихся реагинов), с разными концентрациями аллергена. Полученную смесь подкожно вводят больному, страдающему повышенной чувствительностью к данному аллергену. В качестве контроля служит аналогичная смесь реагентов с сывороткой здорового человека. Присутствие блокирующих антител проявляется в снижении активности смеси.

2. Аналогичным способом можно сравнить сыворотку, взятую у больного до лечения, с сывороткой, полученной после десенсибилизации. Первую сыворотку сохраняют путем замораживания. Через 3-4 недели после десенсибилизации получают другой образец сыворотки. Равные объемы предварительно прогретых образцов сыворотки инкубируют с целым рядом разведений аллергена, а затем эту смесь используют для проведения внутрикожных проб больным атопией. Если титр блокирующих антител достаточно высок, то смесь аллергена со второй сывороткой вызывает положительные реакции лишь при значительных концентрациях аллергена.

Тесты in vitro:

1. Серологический блокирующий тест. Исследуемую сыворотку нагревают до 56 °С с целью инактивации реагинов. Блокирующее действие сыворотки оценивают в следующей системе: аллерген, связанный с сорбентом и меченная антисыворотка.

2. Биологический блокирующий тест. Используют метод, разработанный Lichtenstein и соавт. Предварительно отмытые лейкоциты больного инкубируют в течение 60 мин при 37 °С с экстрактом аллергена, взятого в разных разведениях. В этот период аллерген взаимодействует с реагинами, связанными на базофилах. С помощью флюорометрии можно регистрировать высвобождающийся в процессе реакции гистамин. Количество свободного гистамина соответствует его общему содержанию в лейкоцитах. Используя разные концентрации антигена, можно определить те разведения, которые приводят к 50% высвобождению гистамина. На основании результатов этого метода можно судить о степени клеточной сенсибилизации. Очевидно, существует комплекс механизмов (специфических и неспецифических), влияющих на процесс клеточного реагирования.

Преимущество этих методов in vitro состоит в том, что при обследовании больных лиц и здоровых доноров можно не проводить кожных проб и апробировать значительное количество тест-аллергенов.

С помощью соответствующих модификаций удалось выделить блокирующие антитела, например, при инкубации аллергена с инактивированной сывороткой и последующим контактом с лейкоцитами больного, реагирующего на данный аллерген. В качестве контроля служит реакция аллергена с сывороткой здорового человека. Титр реагина может быть определен в результате пассивной сенсибилизации лейкоцитов донора и реакции высвобождения гистамина при контакте с аллергеном. Исследования Sadan и соавт. показали, что в результате десенсибилизации, проводимой до наступления сезона, титр реагинов у больных поллинозом значительно превышал таковой у нелеченых пациентов контрольной группы. В то время как у больных контрольной группы при введении определенных доз аллергена наблюдался высокий показатель реакции высвобождения гистамина, у десенсибилизированных лиц он был снижен.

Изменение реактивности клеток-мишеней. При десенсибилизации наряду с изменением титра реагинов и выработкой блокирующих антител может изменяться чувствительность клеток-мишеней. Это впервые предположили Van Arsdel и соавт. на основании опытов по изучению феномена высвобождения гистамина. Используя разные дозы антигена, авторы определяли ту, которая необходима для 50% освобождения гистамина из предварительно отмытых клеток. Дальнейшее увеличение дозы антигена в большинстве случаев приводило к снижению показателя. Эти наблюдения позволили обнаружить еще одну особенность: изменение клеточной реактивности не зависит от титра реагинов. Исследования показали, что основу «неспецифической» десенсибилизации составляют разные механизмы. Их действие может быть непродолжительным (вероятно, как результат дегрануляции) или проявляться более длительное время. Кроме того, было установлено, что клинический эффект не всегда коррелирует с этими изменениями.

Результаты кожной пробы и провокационного теста. Довольно часто при успешной десенсибилизации результаты кожных проб существенно не изменяются. Однако при длительном курсе лечения, как правило, в течение 2- 3 лет, происходит снижение клеточно-опосредованных реакций иммунитета, что подтверждается результатами кожных проб. Эффект выражен в большей степени, если выше доза и продолжительнее период терапии. Что касается провокационного теста, то в большинстве случаев по его результатам оценивают эффект лечения.

Результаты экспериментальных исследований, совершенствование методов десенсибилизации. Результаты опытов на животных способствовали выяснению механизмов IgE-продукции, а также факторов, влияющих на процесс десенсибилизации. Цель последней состоит прежде всего в активации механизмов Т-клеточной супрессии или в торможении иммунного ответа.

Совершенствование методов десенсибилизации представляет важный аспект проблемы клинико-иммунологического обследования пациента. Перед исследователями стоят следующие задачи:

- очистка и стандартизация аллергенов;

- выбор дозы и схемы введения аллергена, использование депо-аллергенов;

- применение модифицированных аллергенов

17. Этиология (причины) аллергии Этиология аллергии – аллергены. Понятие аллергены Аллергены – это антигены, вызывающие специфически повышенную чувствительность организма. Не следует путать с аллергенами с понятие «аллергоиды». Аллергоиды – это химически модифицированные аллергены, способные индуцировать образование IgG, но не IgE (блокирующих IgG). Классификация аллергенов Экзоаллергены (попадающие в организм извне) Инфекционные аллергены Бактерии (стафилококки, стрептококки, нейссерии, кишечная палочка, протей и др.) Вирусы Грибы (Aspergillus, Penicillium, Rizopus, Alternaria, Candida, Cladospoium, Pleurotus и др.) Простейшие Паразиты (гельминтов, токсокар, лямблий и др.) Неинфекционные аллергены Ингаляционные аллергены Бытовые аллергены пыль бытовая и производственная споры дрожжеподобных и плесневых грибов клещи домашней пыли корм для рыб (мотыль, дафнии) Эпидермальные аллергены Эпидермис, частицы эпидермиса, перхоть, и волосы человека, шерсть, секреты (слюна, моча и выделение сальных и потовых желёз) животных (кошки, собаки, свиньи, морские свинки, хомяки, лошади и др.). Пыльцевые аллергены пыльца растений: деревьев, злаковых трав, сорных трав (амброзия, полынь обыкновенная, подсолнечник), луговых трав (овсяница луговая, ежа, мятлик) берёзы, дуба и др. Продукты химического производства (промышленные аллергены): краски, синтетические материалы, ядохимикаты, латекс, скипидар, масла, никель, хром, мышьяк, деготь, смола, дубильные вещества, танин, пирогаллол, инсектофунгициды, лаки, фенопласты и аминопласты, формалин, мочевины, химические чистящие средства (стиральный порошок, жидкости для мытья посуды) и др. Лекарства антибиотики, сульфаниламиды, НПВС ит. д. Частицы тел насекомых Энтеральные аллергены Пищевые аллергены (чаще гликопротеиды, реже полипептиды и гаптены): Пищевые продукты: растительные, животные – мёд, рыба, молоко, цитрусовые, орехи, яйца, кунжут, море продукты, бобовые, злаки, томаты и др. Добавки (консерванты, эмульгаторы, красители, др.) Лекарства Метаболиты насекомых (экскременты и пр.) Парентеральные аллергены Лекарства Сыворотки Инсектные аллергены: яды перепончатокрылых насекомых при ужалении (пчелиный, осиные, шмелиные, шершней, оводов, слепней и др. яды) слюна кровососущих насекомых (комары, клопы, мошка) при укусе Эндоаллергены (образующиеся в самом организме) По источнику происхождения неинфекционные аллергены делятся: Бытовые аллергены (шерсть, пыль, перья и т. д.) Природные аллергены (пыльца растений) Промышленные аллергены (мучная, шерстяная пыль) Пути проникновения экзоаллергенов в организм: перкутанный ингаляционный энтеральный парентеральный Эндоаллергены – аутоаллергены Первичные (или естественные) эндоаллергены (аутоаллергены) – это антигены, содержащиеся в некоторых органах (хрусталике глаза, в коллоиде щитовидной железы, сером веществе головного мозга, семенниках) в изолированном от аппарата иммуногенеза состоянии. При повышении проницаемости гистологических барьеров происходит дистопия антигенов этих органов. Контакт с иммунокомпетентными клетками и начинается выработка аутоантител – возникает аутоиммунный тиреоидит, орхит и т. д. Вторичные (приобретенные) эндоаллергены (аутоаллергены) Образуются: Из собственных белков под влиянием вредных факторов (высокая, низкая температура, ионизирующее излучение, ишемия органа). На них вырабатываются антитела. Эти механизмы играют важную роль в развитии лучевой, ожоговой болезней ит. д. Под влиянием воздействия микроорганизмов на белки макроорганизма; Важнейшие медиаторы ГНТ (гиперчувствительность немедленного типа): Первичные – высвобождаются непосредственно в ходе реакции антиген-антитело, находятся уже в готовом виде (гистамин, серотонин) или синтезируются под воздействием антигена (ФАТ, МРС-А (медленно реагирующая субстанция анафилаксии)). Вторичные – высвобождаются при вовлечении в процесс других клеток (гранулоциты – брадикинин). По химической структуре и биологической активности медиаторы подразделяют: действующие на сосуды и гладкую мускулатуру хемотаксические протеогликаны ферменты Медиаторы, действующие на сосуды и гладкую мускулатуру – гистамин (вырабатывается в тучных клетках и базофилах). Тучных клеток много в коже, подслизистом слое кишечника, бронхов) действует на Н1 и Н2 – гистаминовые рецепторы. Стимуляция Н1-рецепторов вызывает: сужение бронхов, коронарных и легочных сосудов; частичное разобщение межклеточных связей в эндотелии венул, что повышает проницаемость венул и капилляров, развитие отека и крапивницы; усиление выделения слизи в верхних дыхательных путях; усиление хемотаксиса эозинофилов и нейтрофилов через вторичные эффекты; повышение внутриклеточной цГМФ; усиление выработки простагландинов F2 альфа, Е2, тромбоксана и других производных арахидоновой кислоты; Н1-рецепторы локализуются главным образом в кровеносных сосудах, и их стимуляция приводит к повышению проницаемости капилляров и вазодилятации. Стимуляция Н2-рецепторов сопровождается: повышением продукции соляной кислоты в желудке расширением коронарных артерий положительным хроно- и инотропными эффектами Н2-рецепторы локализуются преимущественно в сердце, их стимуляция вызывает положительный хроно- и инотропный эффекты. В нормальных условиях содержание гистамина в сыворотке колеблется в пределах 0.4 – 0.8 нг/мл. Увеличение его содержания до 1.6 нг/мл вызывает учащение ЧСС на 30%, до 2.4 нг/мл – заметное покраснение кожи, головную боль, до 4.6 нг/мл – увеличение скорости сокращения левого желудочка, умеренную гипотензию, свыше 12 нг/мл – выраженную гипотензию, при уровне 30нг/мл – происходит остановка сердца. Во время анафилактической реакции концентрация гистамина в плазме крови колеблется от 40 до 140 нг/мл. Высокие концентрации значительно снижают систолическое, диастолическое и среднее давление в аорте, общее сопротивление периферических сосудов, конечное диастолическое давление в левом желудочке и ударный индекс, вызывают учащение ЧСС. Эти эффекты связаны с активизацией симпатоадреналовой системы под прямым действием гистамина. В норме гистамин очень быстро инактивируется тканевыми ферментами: гистамин-N-метилтрансферазой (путём метилирования) гистаминазой (путём окислительного дуаминирования) Его эффект длится не более 5 минут. Длительная гипотензия и дисфункция сердечно-сосудистой системы, наблюдающиеся во время анафилактических реакций развиваются при участии других вазоактивных медиаторов.

18. МЕХАНИЗМ РАЗВИТИЯ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

Типы аллергических реакций (реакций гиперчувствительности). Гиперчувствительность немедленного и замедленного типа. Стадии аллергических реакций. Пошаговый механизм развития аллергических реакций.

1. 4 типа аллергических реакций (реакций гиперчувствительности).

2. Гиперчувствительность немедленного и замедленного типа.

3. Стадии аллергических реакций.

4. Пошаговый механизм развития аллергических реакций.

Сокращения в тексте.

1. 4 ТИПА АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ (РЕАКЦИЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ).

В настоящее время по механизму развития принято выделять 4 типа аллергических реакций (гиперчувствительности). Все эти типы аллергических реакций, как правило, редко встречаются в чистом виде, чаще они сосуществуют в различных сочетаниях или переходят из одного типа реакций в другой тип.

При этом I, II и III типы обусловлены антителами, являются и относятся к реакциям гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ). Реакции же IV типа обусловлены сенсибилизированными Т-клетками и относятся к реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

Обратите внимание!!! Аллергия – это реакция гиперчувствительности, запускаемая иммунологическими механизмами. В настоящее время все 4 типа реагирования считаются реакциями гиперчувствительности. Однако, под истинной аллергией понимают только такие патологические иммунные реакции, которые протекают по механизму атопии, т.е. по I типу, а реакции II, III и IV типов (цитотоксические, иммунокомплексные и клеточные) типов относят к аутоиммунной патологии.

Первый тип (I) – атопический, анафилактический или реагиновый тип — обусловлены антителами класса IgE. При взаимодействии аллергена с IgE, фиксированными на поверхности тучных клеток, происходит активация этих клеток и высвобождение депонированных и вновь образованных медиаторов аллергии с последующим развитием аллергической реакции. Примеры таких реакций – анафилактический шок, отёк Квинке, поллиноз, бронхиальная астма и др.

Второй тип (II) — цитотоксический. При этом типе аллергенами становятся собственные клетки организма, мембрана которых приобрела свойства аутоаллергенов. Это происходит в основном при их повреждении в результате воздействия лекарств, ферментов бактерий или вирусов, в результате чего клетки изменяются и воспринимаются иммунной системой как антигены. В любом случае для возникновения этого типа аллергии, антигенные структуры должны приобрести свойства аутоантигенов. Цитотоксический тип обусловлен IgG- или IgM, которые направлены против Аг, расположенных на видоизменённых клетках собственных тканей организма. Связывание Aт с Аг на поверхности клетки приводит к активации комплемента, который вызывает повреждение и разрушение клеток, последующий фагоцитоз и удаление их. В процесс также вовлекаются лейкоциты и цитотоксические Т-лимфоциты. Связываясь с IgG, они участвуют в формировании антителозависимой клеточной цитотоксичности. Именно по цитотоксическому типу происходит развитие аутоиммунной гемолитической анемии, лекарственной аллергии, аутоиммунного тиреоидита.

Третий тип (III) — иммунокомплексный, при котором ткани организма повреждаются циркулирующими иммунными комплексами с участием IgG- или IgM, имеющими большую молекулярную массу. Т.о. при III типе, так же, как и при II, реакции обусловлены IgG и IgM. Но в отличие от II типа, при аллергической реакции III типа антитела взаимодействуют с растворимыми антигенами, а не с находящимися на поверхности клеток. Образовавшиеся иммунные комплексы длительно циркулируют в организме и фиксируются в капиллярах различных тканей, где активируют систему комплемента, вызывая приток лейкоцитов, высвобождение гистамина, серотонина, лизосомальных ферментов, повреждающих эндотелий сосудов и ткани, в которых фиксирован иммунный комплекс. Этот тип реакций является основным при сывороточной болезни, лекарственной и пищевой аллергии, при некоторых аутоаллергических болезнях ( СКВ, ревматоидный артрит и др).

Четвёртый (IV) тип реакций — гиперчувствительность замедленного типа или клеточно-опосредованная гиперчувствительность. Реакции замедленного типа развиваются в сенсибилизированном организме через 24-48 часов после контакта с аллергеном. При IV типе реакций роль антител выполняют сенсибилизированные Т-лимфоциты. Аг, контактируя с Аг-специфическими рецепторами на Т-клетках, приводит к увеличению количества этой популяции лимфоцитов и их активации с выделением медиаторов клеточного иммунитета — воспалительных цитокинов. Цитокины вызывают скопление макрофагов и других лимфоцитов, вовлекают их в процесс разрушения АГ, в результате чего возникает воспаление. Клинически это проявляется развитием гиперергического воспаления: образуется клеточный инфильтрат, клеточную основу которого составляют мононуклеары — лимфоциты и моноциты. Клеточный тип реакции лежит в основе развития вирусных и бактериальных инфекций (контактный дерматит, туберкулез, микозы, сифилис, лепра, бруцеллез), некоторых форм инфекционно-аллергической бронхиальной астмы, реакции отторжения трансплантата и противоопухолевого иммунитета.

Тип реакции Механизм развития Клинические проявления

Тип I Реагиновые реакции Развивается в результате связывания аллергена с IgE, фиксированного на тучных клетках, что приводит к выбросу из клеток медиаторов аллергии, которые и вызывают клинические проявления Анафилактический шок, отёк Квинке, атопическая бронхиальная астма, поллиноз, конъюнктивит, крапивница, атопический дерматит, др.

Тип II Цитотоксические реакции Обусловлены IgG или IgM, которые направлены против Аг, расположенных на клетках собственных тканей. Происходит активация комплемента, который вызывает цитолиз клеток-мишеней Аутоиммунные гемолитические анемии, тромбоцитопения, аутоиммунный тиреоидит,лекарственный агранулоцитоз, др.

Тип III Иммунокомплексные реакции, опосредованные иммунными комплексами Циркулирующие иммунные комплексы с IgG или IgM фиксируются к стенке капилляров, активируют систему комплемента, инфильтрацию ткани лейкоцитами, их активацию и продукцию цитотоксических и воспалительных факторов (гистамина, лизосомальных ферментов, др.), повреждающих эндотелий сосудов и ткани. Сывороточная болезнь, лекарственная и пищевая аллергии, СКВ, ревматоидный артрит аллергический альвеолит, некротические васкулиты, др.

Тип IV Клеточно-опосредованные реакции Сенсибилизированные Т-лимфоциты, контактируя с Аг, продуцируют воспалительные цитокины, которые активируют макрофаги, моноциты, лимфоциты и повреждают окружающие ткани, образуя клеточный инфильтрат. Контактный дерматит, туберкулез, микозы, сифилис, лепра, бруцеллез, реакции отторжения трансплантата и противоопухолевого иммунитета.