-
Вирусология и биотехнология.
Учебный элемент 1: «Проведение вирусологического анализа патологического материала».
В лаборатории полученный патматериал освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают, взвешивают и измеряют. Часть материала берут для вирусологических исследований, оставшуюся часть хранят в холодильнике на случай дополнительных исследований.
Подготовка органов и тканей. Вирус необходимо высвободить из клеток органов и тканей и перевести в фосфатный буфер или раствор Хенкса. Для этого материал тщательно измельчают ножницами и растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Добавлять толченое стекло менее желательно, так как оно обладает щелочными свойствами и может инактивировать часть вирусных частиц. Но и на тонко растертых песчинках или частицах стекла, обладающих большой поверхностью, часть вируса может адсорбироваться и уйти затем в удаляемый осадок. Из растертого материала обычно готовят 10%-ную суспензию на фосфатном буфере или растворе Хенкса. Полученную суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и освобождают от микрофлоры, либо пропуская через бактериальные фильтры (это делают редко, так как теряется много вируса за счет адсорбции на фильтре), либо обрабатывая антибиотиками широкого спектра действия (пенициллин, стрептомицин, нистатин, тетрациклин, кристалломицин и т. д.). Следует избегать излишне больших доз антибиотиков, так как их избыток при дальнейшем внесении в культуру клеток может вызвать неспецифическую дегенерацию последних. Предпочтительность тех или иных доз антибиотиков и оптимальный режим центрифугирования в каждом конкретном случае указываются в инструкции по диагностике соответствующих вирусных болезней.
Экспозиция суспензии с антибиотиками не менее 30—60 мин при комнатной температуре, затем материал подвергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. После получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов или культур клеток. В случае положительного бактериологического контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке антибиотиками и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при минус 20 — минус 70 °С.
Подготовка выделений из носа, глаз. Тампоны, погруженные в соответствующий раствор, встряхивают 10—15 мин, тщательно отжимают, полученную жидкость центрифугируют 20 мин при 2—3 тыс. оборотах/мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку и в нее добавляют пенициллин и стрептомицин по 500—1000 ЕД на 1 мл, выдерживают и после бактериологического контроля используют для заражения. Из осадка клеток готовят мазки для РИФ.
Подготовка фекалий. Пробу кала (приблизительно1 г) помещают в баночку с бусами, содержащую 10 мл раствора Хенкса или фосфатно-буферного раствора. После гемогенизации материала встряхиванием и последующего центрифугирования при 2—3 тыс. мин-1 в течение 30 мин надосадочную жидкость отсасывают, добавляют пенициллин, стрептомицин по 500—1000 ЕД/мл, нистатин 30 ЕД/мл и 200 мкг тетрациклина на 1 мл. После 30—60-минутного контакта производят посев па стерильность, замораживают и хранят при минус 10 — минус 20 °С. В день заражения исследуемый материал оттаивают и повторно центрифугируют для удаления вновь образующегося после замораживания осадка. Неиспользованный материал хранят в замороженном состоянии до конца исследования.
Исследование кала может быть заменено ректальными мазками, обработка которых требует меньше времени, а частота выделения вируса при этом не только не меньше, но иногда выше, чем при исследовании кала.
Мочу обрабатывают антибиотиками (500—1000 ЕД/мл) и используют для заражения.
Содержимое папул, пузырьков и пустул, чешуйки и корки исследуют при кожных высыпаниях. Содержимое папул и пузырьков разводят физиологическим раствором 1:5, а корки, чешуйки после растирания суспендируют в солевом растворе 1:5—1:10 и центрифугируют при
3 —3 тыс. мин-1 в течение 10—15 мин. После обработки пенициллином и стрептомицином (по 200—500 ЕД/мл) материал используют для заражения.
Подготовка крови. Для выделения вируса может быть использована либо цельная дефибринированная, либо «лаковая» кровь, либо кровь с антикоагулянтом. В последнем случае берут 5 мл крови в пробирку с 5—6 каплями гепарина и замораживают. После оттаивания гемолизированную кровь центрифугируют при 2 —3 тыс. мин-1 в течение 15 мин, добавляют пенициллин и стрептомицин из расчета 100—200 ЕД/мл и после проверки на стерильность используют для заражения. Для этих целей пригодна и свернувшаяся кровь. Ее растирают в ступке и добавляют небольшое количество раствора Хенкса (1:1 или 1:2).
Отбор крови для серологических исследований. Для серологической диагностики необходимо иметь сыворотки двух проб крови (парные сыворотки), взятых в начале и в конце болезни. Первую пробу берут как можно раньше – в инкубационный период или в начале проявления клинических симптомов болезни, вторую – во время выздоровления или через 2-3 недели после заболевания. Брать кровь и готовить сыворотку необходимо стерильно, нельзя применять антикоагулянты или консерванты, которые могут сделать сыворотку антикомплементарной, а в реакции нейтрализации оказать инактивирующее действие на вирус или оказаться токсичными для культур клеток либо просто нестерильными. Кровь в объеме 10-15 мл берут в стерильные пробирки с резиновыми пробками, выдерживают при комнатной температуре до образования сгустка, обводят стеклянной палочкой и переносят в холодильник при 4°С на 18-20 ч. После максимальной ретракции сгустка сыворотку отсасывают, добавляют антибиотики – пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл, проводят высевы на бактериологические среды. Вместо отстаивания в холодильнике можно после обведения кровь центрифуговать.
Учебный элемент 2: «Проведение серологического анализа».
Этот раздел я рассмотрю на примере серологических реакций при бешенстве.
При постановке реакций на бешенство используются РИФ, РДП.
РИФ: используются антирабический гамма-глобулин. На обезжиренных предметных стеклах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов головнного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарии, мозжечок и продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратом каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, под челюстные слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).
Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 15 — минус 20 °С) от 4 до 12 ч, высушивают на воздухе, наносят флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влажную камеру при 37 °С на 25—30 мин, затем тщательно промывами физиологическим раствором или фосфатным буфером с pH 7,4, споласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, наблюдаются разной величины и формы флуорес цирующие желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще ши клеток. В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах. Отрицательным считают результат при отсутствии специфической флуоресценции.
Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.
В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и т. д., а также материал, имеющий признаки даже незначительного загнивания.
РДП в агаровом геле. Метод основан на свойстве антител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при втрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген + антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспериментальной инфекции (биопроба).
Реакцию ставят на предметных стеклах, на которые наливают 2,5—3 мл расплавленного 1,5%-ного раствора агара. После застывания в агаре делают лунки диаметром 4-5 мм по трафарету, помещенному под предметное стекло с агаром. Агаровые столбики вынимают ученическим пером. Лунки в агаре заполняют компонентами по схеме:
От крупных животных исследуют все отделы головного мозга (левой и правой стороны), от средних (крысы, хомяки и др.) — какие-либо три отдела мозга, у мышей — весь мозг. С помощью пинцета из мозга готовят пастообразную массу, которую и помещают в соответствующие лунки.
Контроли с положительным и отрицательным антигенами ставят на отдельном стекле по тому же трафарету. После заполнения лунок компонентами препараты помещают во влажную камеру и ставят в термостат при 37 °С на 6 ч, затем при комнатной температуре — на 18 ч. Учет результатов ведут в течение 48 ч.
Реакцию считают положительной при появлении одной или 2-3 линий преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический гамма-глобулин.
Бактериальная нестерильность и загнивание мозга не препятствуют использованию его для РДП. Материал, консервированным глицерином, формалином и другими средствами, для РДП непригоден.
Учебный элемент 3: «Кормление и уход за лабораторными животными. Биопроба».
В вирусологии используют кроликов, морских свинок, белых крыс, белых мышей, золотистых хомячков. Однако только некоторые вирусы удается культивировать на животных этих видов. Во многих случаях для тех же целей используют других чувствительных к данному вирусу животных: кур, голубей, котят, щенков и т. д. Так, биопробу при диагностике оспы птиц ставят на курах, оспы овец – на овцах, чумы свиней – на подсвинках.
Большинство вирусов лучше размножается в организме молодых или даже новорожденных животных. Также лабораторные животные должны быть здоровы.
Заражают животных различными методами: подкожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, интраназальное, интрацеребральное.
Лабораторных животных размещают так, чтобы, с одной стороны, было обеспечено функционирование всех систем организма в пределах физиологической нормы, с другой — исключено взаимное перезаражение и распространение инфекции за пределы вивария. Животных содержат в виварии с учетом их физиологической потребности в освещенности и температуре. Так, мышам, крысам нужны полумрак и температура воздуха около 20 °С, морским свинкам, кроликам и курам — дневной свет и температура в пределах 16—23, 14—18 и не ниже 0 °С соответственно. Плотность посадки должна составлять примерно 1 г массы лабораторных животных на 1 см2 дна клетки. Животных обеспечивают регулярным и полноценным кормлением и постоянно питьевой водой. Если виварий один, зараженных животных содержат изолированно от здоровых и с последних начинают уборку помещения и кормление. Для ухода за зараженными животными используют отдельный инвентарь и кормушки. Лучше иметь два вивария: для содержания здоровых и зараженных животных.
По окончании экспериментов клетки дезинфицируют, погибших животных обезвреживают сжиганием в печах или автоклавированием.
Учебный элемент 4: «Биопрепараты. Способы хранения и утилизации»
Использовали:
1.Инфорс
2.ВанШотУльтра
3.Байкокс 5%
4.Сыворотка «Иммуносерум»
Биопрепараты хранятся в холодильнике, при температуре +4°С. Неиспользованные препараты утилизируют кипячением или автоклавированием. При утилизации заполняется соответствующий акт. По истечении срока годности препараты бракуют или отправляют (если осталось много) на контроль (в этом случае срок годности может быть продлен).