5. Ветеринарная микробиология и микология.

Учебный элемент 1: «Ознакомление с помещением и оборудованием ветеринарной лаборатории. Техника безопасности. Документация»

Ветеринарная лаборатория предназначается для осуществления диагностических исследований, контроля за санитарным качеством кормов и качеством проводимой дезинфекции. Ветеринарная лаборатория осуществляет проведение профилактических, лечебных и ветеринарно-санитарных мероприятий.Ветеринарные лаборатории могут размещаться также на территории городов и иных населенных пунктов. В этом случае они обслуживают близлежащие хозяйства и поголовье животных, находящееся у населения.

В состав ветеринарной лаборатории входят:

- лабораторное отделение (лабораторный корпус);

- склад дезсредств.

В лабораторном отделении (корпусе) размещаются:

- комнаты специалистов;

- аптека;

- кладовая для биопрепаратов (с холодильником);

- бактериологическое отделение, в состав которого входят, как минимум, два стерильных бокса;

- химико-токсиологическое отделение;

- паразитологическое отделение;

- моечная - стерилизационная;

- комната для подготовки проб для исследований и проведения лечебно-профилактических мероприятий.

Лабораторный корпус, как правило, проектируется и строится вместе с виварием, в состав которого входят помещения для подопытных животных и птиц, помещения для кормов.

В состав склада дезсредств, который располагается недалеко от ветеринарной лаборатории, входят кладовые для дезсредств.

Учебный элемент 2: «Способы взятия патологического материала от животного.Методы консервирования, упаковки и транспортирования патологического материала для бактериологического исследования. Сопроводительная документация»

Патологический материал необходимо брать стерильными инструментами в стерильную посуду. Поверхность органа (ткани), от которого берут патологический материал, на месте разреза следует обжечь над пламенем или прижечь нагретой металлической пластинкой.

Патологический материал должен быть взят как можно раньше после смерти животного, особенно в теплое время года, т.к. сразу же после заболевания (или впервые же 1-2 дня) барьерная роль кишечника значительно ослабевает, что наряду с повышенной проницаемостью кровеносных сосудов способствует диссиминации кишечной флоры.

Кроме того, по мере углубления инфекционного процесса количество вируса может снижаться в результате одновременного воздействия защитных сил организма.

Следует учитывать, что при многих вирусных инфекциях наблюдается феномен посмертной аутостерилизации, в результате чего вирус может быть вообще не обнаружен или его количество окажется очень незначительным.

Вторая причина необходимости экстренного взятия материала – избежать посмертных изменений в тканях, иначе они могут оказаться непригодными для бактериологических и вирусологических исследований.

Для вирусологических исследований желательно направлять пробы от животных в трех стадиях болезни:

• от больных с выраженной клиникой с указанием температуры, частоты пульса и дыхания (кровь, кость, лимфатические узлы и пораженные органы);

• от убитых в агонии (кровь, кость, лимфатические узлы и пораженные органы);

• от выздоравливающих животных (кровь).

Взятые пробы следует как можно быстрее поместить в условия, обеспечивающие замедление процессов разложения материала. Такие условия обеспечивают низкие температуры.

Если патологический материал невозможно доставить в лабораторию в течение ближайших 24-30 часов, его посылают только в консервированном виде.

Патологический материал (органы или их части) консервируют 30-50%-ным раствором химически чистого глицерина на физиологическом растворе. Физиологический раствор предварительно стерилизуют при 120⁰С в течение 30 мин.

Материал можно консервировать также в стерильном вазелиновом масле. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве 4-5 раз, превышающем его объем. Консервированные образцы желательно хранить в холодильнике.

Небольшие трупы (поросят, мелких животных можно посылать целиком во влагонепроницаемой таре).

Трубчатые кости посылают на исследование в целом виде, очищенными от мышц и сухожилий. Кости завертывают в марлю или полотно, смоченные дезинфицирующей жидкостью и пересылают в сейф - пакетах или в стерильных полиэтиленовых пакетах.

Кишечник перед посылкой для бактериологического и вирусологического исследований освобождают от фекальных масс, а концы кишечника перевязывают. На исследование посылают части кишечника с наиболее характерными патологическими изменениями.

Кишечник помещают в банки с 30%-ным водным раствором глицерина или насыщенным водным раствором поваренной соли. Объем консервирующей жидкости должен превышать объем взятого материала в 4-5 раз.

Кал для исследования отправляют в стерильных стаканах, пробирках, банках, которые закрывают пергаментной бумагой, пробками или в контейнерах.

Кал от трупов животных можно послать в отрезке невскрытого кишечника, завязанного с обоих концов, он должен быть доставлен в лабораторию не позднее 24 ч после его взятия.

Для исследования участков кожи берут наиболее пораженные ее кусочки размером 10x10 см и посылают в стерильной, герметически закупоренной посуде.

Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Из каждой доли вымени берут последние порции молока по 10-15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.

Пробы мочи берут катетером в стерильную посуду. При его отсутствии мочу получают при естественном мочеиспускании или, вызывая последнее, раздражением наружных половых органов.

Пробы слизи из половых органов животных берут стерильным марлевым тампонам при помощи специальных инструментов конструкции Павловского, Жавордова, Казеева, а также применяемых при искусственном осеменении коров шприца-катетера или полистироловой пипетки, соединенной со шприцем.

Для получения смывов слизистой оболочки носовой полости, половых органов, конъюнктивы и др. полость орошают стерильным физиологическим раствором или солевым раствором Хенкса (см. приложение) и собирают стекающий раствор в емкости.

Иногда для получения смывов в полость вводят стерильный ватный тампон, смоченный физиологическим или солевым сбалансированным раствором. Тампоном тщательно протирают слизистую, извлекают его и помещают во флаконы с аналогичным раствором.

Мазки из носа, полости рта, прямой кишки и т.д. берут при помощи стерильных ватных тампонов на довольно длинных стерильных деревянных палочках. После взятия мазка тампон помещают в пробирку, заполненную соответствующей жидкостью.

Наиболее часто для этого используют реактив Хенкса с антибиотиками (пенициллин, стрептомицин, нистатин) и белковым стабилизатором, например, с 0,5% желатина или 0,5-1% альбумина бычьей сыворотки.

Упаковка и пересылка патологического материала

Трупы мелких животных, части трупов животных и отдельные органы в свежем (нефиксированном) виде отправляют для исследования в лабораторию только с нарочным.

Посылаемый материал должен быть тщательно упакован, чтобы предупредить возможность рассеивания инфекции в пути.

Упаковка должна быть трехслойной:

1) емкость, содержащая пробу, должна быть водонепроницаемой, а в случае использования подвижных буферных растворов - герметичной;

2) внутренняя упаковка должна быть водонепроницаемой с достаточным количеством поглощающего материала на случай утечки для впитывания всей жидкости, содержащейся в пробе (вата, бумага);

3) наружная упаковка предназначена для защиты внутренней от физических повреждений и воды (герметичный термоконтейнер).

При перевозке наиболее надежным способом консервирования вируссодержащих проб является их замораживание. При транспортировке проб на дальние расстояния следует использовать сухой лед. В качестве емкости для материала и льда используют пластмассовые контейнеры, легкие по массе, с хорошей теплоизоляцией, небьющиеся и прочные.

Следует избегать колебаний температуры, особенно резких ее перепадов, а также повторных замораживаний и оттаиваний. Температура является определяющим фактором, влияющим на выживаемость вируса во время перевозки. Титр вируса снижается очень быстро, если температура среды, в которой его транспортируют, поднимается выше 20⁰С; у большинства вирусов это снижение происходит настолько быстро, что превращает последующее выделение вируса в пустую трату времени.

Если замораживание невозможно, то следует использовать один из следующих консервирующих растворов

Кроме правильно выбранного материала, взятого в подходящие сроки и пересланного с соблюдением необходимых условий, лаборатория нуждается в определенной информации, касающейся больного и диагностических проб. Вместе с пробами направлять подробное описание динамики заболевания животного (время появления, быстрота охвата, процент заболеваемости, наличие летальных исходов или тяжелых осложнений, период переболевания, клиническая картина, протокол вскрытия, чем лечили, прививали).

На взятый материал составляют сопроводительный документ с указанием хозяйства, даты и времени взятия, количества.

Если при вскрытии посылки в лаборатории обнаруживается несоответствие сопроводительному документу или порча патологического материала, то обязательно составляют акт, копию которого отправляют ветеринарному врачу, направлявшему материал в лабораторию.

Учебный элемент 3: «Освоение микроскопических методов исследований»

Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле мы делали мазок, высушивали, фиксировали его и после этого окрашивали. Исследуемый материал распределяется тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Мазки готовят из культур микробов, патологического материала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов.

Методика приготовления препарата:

1. Приготовление мазка.

На предметном стекле с обратной стороны карандашом по стеклу обводят круг диаметром 2-3 см. Жидкий исследуемый материал берут петлей и распределяют в области круга, а микробную культуру с поверхности плотной питательной среды снимают бактериальной петлей и растирают на предметном стекле в капле заранее нанесенной воды. Из кусочков паренхиматозных органов делают мазки-отпечатки, для этого местом свежего среза прикасаются к предметному стеклу, делая несколько отпечатков. Обязательное условие – мазок должен быть очень тонким.

2. Высушивание мазка производится на воздухе, для ускорения процесса можно сушить в теплом потоке высоко над спиртовкой.

3. Фиксация мазка преследует две цели: прикрепить бактерии к предметному стеклу и убить их, так как убитые микробы лучше окрашиваются. Фиксируют физическим или химическим методом. Суть физического – в медленном проведении стекла с мазком через пламя горелки, это грубый метод фиксации, который может привести к деформации формы клеток. При химическом методе фиксации препарат на 15 минут погружают в смесь Никифорова (равные объемы спирта и эфира), метод щадящий.

4. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю—Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений. При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор – анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители — генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены. Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе.

Механизм и этапы окраски по Граму.

1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин снять ее, а краситель слить.

2. Нанести раствор люголя на 1-2 мин (йод)

3. Обесцветить этиловым спиртом в течении 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промыть водой

5. Докрасить водным р-ом фуксина в течении 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

* Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный.

Механизм и этапы окраски по Цилю-Нельсону.

1. На фиксированный мазок нанести карболовый р-р фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин

2. Снять бумагу, провыть мазок водой

3. Нанести 5% р-р серной кислоты или 3% р-р смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для обесцвечивания.

4. Промыть водой

5. Докрасить мазок водным р-ом метиленового синего в течении 3-5 мин

6. Промыть водой, высушить и микроскопировать

* Некислоустойчивые – обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислоустойчивые остаются окрашенными фуксином в красный.

Учебный элемент 4: «Проведение лабораторного анализа патологического материала на наличие возбудителя инфекции»

Лабораторная диагностика сибирской язвы.

Все работы по забору, транспортированию и подготовке проб клинического и секционного материала от людей и животных, из объектов окружающей среды осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности».

Материалом для исследования является ухо павшего животного, на которое с особыми мерами предосторожности накладывают две лигатуры, а место среза прижигают. Исследуемый материал помещают во влагонепроницаемую тару, пломбируют, указывают верх тары, оформляют сопроводительный документ и направляют в лабораторию.

Микроскопическое исследование: в лаборатории из крови уха делают мазок, окрашивают по Граму, капсулы по Ольту (или Михину), а также обрабатывают сибиреязвенными люминисцирующими сыворотками. В препаратах, окрашенных по Граму, видны крупные грамположительные палочки (6-10 мкм), соединенные в короткие цепочки. В препаратах, окрашенных по ольту или Михину, концы палочек, обращенных друг к другу, резко обрублены и слегка втянуты, свободные концы закругленные, клетки окружены общей капсулой, что является важным диагностическим признаком.

Для выделения чистой культуры возбудителя, который является факультативным анаэробом, исследуемый материал вносят в МПБ и МПА и выдерживают 24 часа в термостате при 37 °С. Выросшие культуры просматривают, изучают культуральные свойства. Типичные для B. Anthracis крупные, серо-белые колонии R-формы, края которых под малым увеличением имеют вид завитков, получивших название «львиная грива». В препаратах, приготовленных из агаровой бактериальной культуры, бактерии располагаются в виде длинных цепочек. МПБ остается прозрачный, на дне проявляется хлопьевидный осадок. По мере старения бактерий, при накоплении продуктов метаболизма в культуральной жидкости, возбудитель сибирсокой язвы образует споры (бациллы), располагающиеся в центре палочки. Они не образуются при температуре ниже 12 °С и выше 42 °С, а также в живом организме и невскрытом трупе.

Для выделения чистой культуры возбудителя сибирской язвы из исследуемого материала, загрязненного посторонней микрофлорой, делают посев в селективные среды, в состав которых вводят 200-500 ЕД/мл полимиксина в сочетании с триметопримом, которые подавляют рост E. Coli, B. Subtilis, B. Cereus и др.

Для дифференциации выделенной культуры от сапрофитов ставят тест «Жемчужное ожерелье». Для чего готовят ряд последовательных разведений пенициллина и три колбочки с 20 мл расплавленного и охлажденного до 50 °С МПА. В первую колбу вносят 10 ЕД пенициллина, получают агар, содержащий 0,5 ЕД/мл; во вторую колбу вносят 1 ЕД пенициллина и получают агар с 0,05 ЕД/мл пенициллина; третью колбочку оставляют без пенициллина для контроля. Содержимое всех трёх колбочек разливают в стерильные пробирки по 5 мл в каждую с скашивают. Во все пробирки вносят по 0,25 мл 3-часовой исследуемой бульонной культуры. Посевы помещают в термостат при 37 °С в наклонном положении, так что бы бульонная культура распределилась по всей поверхности косого агара. Через три часа из конденсационной жидкости пробирок берут каплю материала, делают мазок, высушивают на воздухе, фиксируют химическим методом и окрашивают простым методом или по Граму. Под воздействием пенициллина только палочки сибирской язвы изменяются и приобретают шаровидную форму, появляется сходство с ожерельем из бус, поэтому при микроскопии такой культуры будут видны цепочки из шарообразных форм – феномен «Жемчужного ожерелья».

Гемолитическую способность изучают посевом выделенной культуры на кровяной МПА в чашках Петри. Возбудитель сибирской язвы, в отличие от сапрофитов, не обладает гемолитическими свойствами.

Если на исследование поступил загнивший материал, из него нельзя выделить чистую культуру и поэтому в нем определяют наличие специфических антигенов при помощи реакции кольцепреципитации. Для этого материал кипятят в физиологическом растворе (1:10) 30-40 минут. Полученный экстракт фильтруют через асбестовую вату и исследуют по обычной методике в РП.

Для постановки биопробы на животных часть исследуемого материала растирают в ступке с небольшим количеством физиологического раствора. Двум белым мышам вводят 0,2-0,5 мл гомогената под кожу в области спины. Наблюдение ведут в течение 10 дней, в случае гибели мышей их вскрывают: из крови сердца, печени, селезенки и места заражения готовят мазки, а из органов делают посевы для выделения чистой культуры.

Основанием для постановки диагноза на сибирскую язву является: наличие в мазках из патологического материала капсулообразующих бактерий, а в препаратах из колоний – грамположительных, неподвижных бацилл; на питательных средах – характерный рост; чувствительность к пенициллину и батериофагу, положительный тест РП и положительный результат биологической пробы.