М. В. Бадлеева Краткий курс лекций по микробиологии

Короткие сроки воспроизводства (бактерии делятся в течение 20-60 мин, дрожжеподобные грибы – 1,5-2,0 ч., животная клетка – 24 ч.), т.е. за ограниченное время можно нарастить огромное количество биомассы. Биосинтез сложных веществ (белки, а/б, а/г, а/т и др.) значительно экономичнее и технологически доступнее. Исходное сырье для биосинтеза дешевле и доступнее, чем сырье для других видов синтеза (используются отходы сельскохозяйственные, рыбной продукции, пищевой промышленности, растительное сырье). Возможно проведение биотехнологического процесса в промышленных масштабах (наличие технологического оборудования, доступность сырья, технология переработки и т. д.).

Продукты одноклеточных в биотехнологии: сами клетки – ис-

точник целевого продукта; крупные молекулы – продукты синтеза клеток: ферменты, токсины, а/г, а/т, пептидогликаны и др.; первичные метаболиты – низкомолекулярные вещества для роста клеток (аминокислоты, витамины, нуклеотиды, органические кислоты и др.); вторичные метаболиты (идиолиты) низкомолекулярные и макромолекулярные соединения, не требующиеся для роста клеток (антибиотики, алкалоиды, токсины, гормоны и др.). Для получения инсулина используется поджелудочная железа КРС и свиней. Для получения гормона роста – гипофизы трупов человека. Для получения Ig используют организм лошадей и других животных, препаратов крови – доноров.

Микроорганизмы и процессы в биотехнологии. На Земле сущест-

вует около 100 тыс. видов бактерий, не считая грибов (250 тыс. видов), вирусов, простейших. В практике используют не более 100 видов микроорганизмов, т.к. остальные мало изучены. Например, дрожжи используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении соков, кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток.

Бактерии используются в биотехнологии. Род Асеtоbасter – для превращения этанола в уксусную кислоту, углекилый газ и воду; род Васillиs – для получения ферментов, средств защиты растений; род Сlоstridium – для сбраживания cахаров в ацетон, этанол, бутанол; псевдомонады – для получения витамина В12; Соrinеbасtеriuт gеntamicum – для получения аминокислот; грибы – для получения разнообразных антибиотиков.

Генетическая инженерия основана на обмене генами между 2- мя хромосомами, который приводит к возникновению клеток или

51

организмов с двумя и более наследственными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой.

Метод генной инженерии заключается в выделении или синтезе ДНК из отличающихся друг от друга организмов или клеток; в получении рекомбинантных молекул ДНК; введении рекомбинантных молекул в живые клетки; создании условий для получения новых клональных клеток.

Ферменты генной инженерии: рестриктазы ДНК; рибозимы РНК

– ферменты, необходимые для получения генетических образований определенной длины.

Технология генной инженерии

Небольшие гены могут быть получены с помощью химического синтеза.

Вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот, и по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене (каждой аминокислоте соответствует три нуклеотида (кодон).

С помощью синтезатора создают химическим путем ген, аналогичный природному гену.

Полученный ген с помощью ферментов лигаз сшивают с другим геном (вектором) для встраивания гибридного гена в клетку.

Вектором могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека и т.д.

Для РНК-вирусов передача генетической информации возможна с помощью ревертазы (обратной транскриптазы), которая передает информацию о структуре белка от РНК к ДНК, и является комплементарной иРНК.

Синтезированный ген в виде рекомбинатной ДНК (плазмида, фаг, вирусная ДНК) встраивается в бактериальную или животную клетку, появляется новое свойство продуцировать несвойственное этой клетке вещество, кодируемое этим геном.

Реципиентом встраиваемого гена могут служить Е. соli, псевдомонады, дрожжи, вирусы.

Также учитывают уровень синтеза вещества, возможности его секреции в окружающую среду, легкости и доступности массового культивирования, экологической безопасности.

Штаммы рекомбинантных бактерий способны переключать на синтез чужеродного вещества до 50 % своей синтетической возможности.

52

Такие штаммы – суперпродуценты целевых продуктов – уже получены и применяются в биотехнологической промышленности: суперпродуценты триптофана, интерферона и других веществ.

Также с целью повышения уровня секреции целевого белка к гену целевого белка присоединяют ген-индикатор.

В результате этой манипуляции получают химерный белок, а из него – целевой белок.

В качестве индикатора может быть, например, β- галактозидаза, можно использовать ген интерферона и т. д.

Продукты генной инженерии. Препараты медицинского и вете-

ринарного назначения: рекомбинантные штаммы-суперпродуценты: вакцины против гепатита В, интерлейкины -1, -2, -3, -6 и др., инсулин, гормоны роста, интерфероны α, β, γ, ФНО, антигены ВИЧ, фактор свертываемости крови и т.д.

Препятствия для развития генной инженерии:

Экологическая настороженность к генно-инженерным препаратам и рекомбинантным штаммам м/о. Хотя в настоящее время доказана их безопасность при соблюдении определенных правил.

Использование рекомбинантных штаммов-продуцентов требует разработки технологических процессов, что значительно дороже, чем получение штамма.

Требуется проведение исследовательских работ для доказательства их идентичности, решения задач по приданию натуральных свойств продукту.

Тем не менее генно-инженерный способ относится к числу самых перспективных при получении многих белковых биологических веществ, ценных для медицины.

Лекция 11

ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ. АНТИБИОТИКИ

Противомикробные средства подразделяют на две группы:

не обладающие избирательностью действия: губительны в отношении большинства микробов (антисептики, дезинфектанты), но токсичны для человека;

53

др. Механизм действия: они являются структурными аналогами парааминобензойной кислоты и нарушают синтез фолиевой кислоты,

ачерез него – синтез ДНК.

3.Диаминопиримидины – препараты антиметаболиты. Они подменяют пиримидиновые основания, спектр их действия шире, чем у сульфаниламидов (триметоприм, пириметамин – антипротозойные препараты).

4.Нитрофурановые препараты – это производные пятичленного гетероциклического соединения – фурана: фурациллин, фурагин, фуразолидон и др. Механизм действия: одновременная блокада нескольких ферментных систем микроорганизмов.

5.Хинолоны – это группа химиотерапевтических веществ, полученных на основе: собственно хинолонов: неграм, невиграмон; производных хинолонов: 4-аминохинолон, 8-аминохинолон (нитроксолин – 5-НОК); фторхинолонов: офлоксацин, ципрофлоксацин, ломефлоксацин (максаквин). Механизм действия хинолонов: нарушение на различных этапах (репликации, дупликации, транскрипции, репарации) синтеза ДНК микробной клетки. Не оказывают влияния на анаэробы, а налидиксовая кислота (неграм) активна только в отношении грам(-) м/о.

6.Азолы – это группа различных производных имидазола: клотримазол, миконазол (монистат), кетоконазол (низорал) и др. – обладают антимикотической активностью. Механизмы действия: ингибирование биосинтеза стеролов ведет к повреждению наружной клеточной мембраны грибов и повышению ее проницаемости, ингибирование синтеза триглицеридов, фосфолипидов, увеличение активности окисления и уменьшение активности ферментов, тормозящих образование свободных радикалов, что способствует к внут-

риклеточному накоплению Н2О2 и повреждению клеточных органелл.

7.Антибиотики – это группа соединений природного происхождения (или их полусинтетических и синтетических аналогов), обладающих антимикробным или противоопухолевым действием.

Антибиотики – это химиотерапевтические препараты (от греч. anti – против, bios – жизнь) из химических соединений биологического происхождения (природные), а также их полусинтетические производные и синтетические аналоги с бактерицидным или бактериостатическим действием.

История создания антибиотиков

55

В основу разработки антибиотиков положены возможности микробного антагонизма.

Л. Пастер: гнилостные бактерии подавляют рост сибиреязвенных бактерий при совместном выращивании на плотных средах.

И.И. Мечников: молочнокислые бактерии подавляют рост гнилостных бактерий.

В 1940 г. Э. Чейн и Г. Флори получили очищенный препарат пенициллина, пригодный для клинических целей.

Источники получения антибиотиков: плесневые грибы (пени-

циллин, полусинтетические производные: метициллин, оксациллин; ампициллин, цефалоспорины); актиномицеты (стрептомицин, тетрациклин, канамицин, рифампицин и др.); бактерии (грамицидин, полимиксины); высшие растения – фитонциды лука, чеснока; ткани животных – лизоцим, интерферон.

Способы получения антибиотиков: биологический синтез (про-

изводство природных антибиотиков); биосинтез с последующими химическими модификациями; химический синтез (получение синтетических аналогов).

Классификация антибиотиков основана на следующих принци-

пах:

источник получения; химическое строение;

механизм и спектр антимикробного действия; способ получения.

По химической структуре антибиотики сгруппированы в се-

мейства: бета-лактамы (пенициллин, цефалоспорины, монобактамы); гликопептиды; аминогликозиды; тетрациклины; макролиды (и азалиды); линкозамиды; левомицитин; рифамицины; полипептиды; разные антибиотики (фузидиевая кислота, фузафунжин и др.).

Механизмы антимикробного действия

нарушение синтеза клеточной стенки бактерий (пенициллин, цефалоспорины);

блокирование или снижение скорости синтеза белка в клетке (стрептомицин, тетрациклин, левомицитин);

угнетение синтеза нуклеиновых кислот в бактериальных клетках (рифампицин).

Осложнения при антибиотикотерапии: аллергические реакции;

кандидозы кожи, слизистых оболочек, внутренних органов; дисбак-

56

териозы (нарушение нормального состава микрофлоры); органотоксичность; гиповитаминоз.

Биологическая активность антибиотиков. Биологическая ак-

тивность антибиотиков измеряется в международных единицах действия (ЕД). Единица активности антибиотика – наименьшее количество препарата, которое оказывает антимикробное действие на чувствительные к нему тест-бактерии (для пенициллина – золотистый стафилококк, стрептомицина – кишечная палочка).

Чувствительность микроорганизмов к АБП. Критерием чувст-

вительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная концентрация антибиотика, ингибирующая рост возбудителя заболевания (МИК). Для определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) используется только чистая культура возбудителя, полученная до антибактериальной терапии.

Лекарственная устойчивость бактерий. Антибиотикорези-

стентность – это устойчивость микробов к антимикробным химиопрепаратам. В настоящее время лекарственная устойчивость микроорганизмов – не только чисто микробиологическая, но и огромная государственная проблема. Показатели заболеваемости, смертности

ит.д. во многом зависят от уровня лекарственной чувствительности. Различают естественную, или природную, и прибретенную лекарственную устойчивость микроорганизмов.

Естественная лекарственная устойчивость. Существуют роды

исемейства м/о, природно-устойчивые к отдельным АБП: в их геноме есть гены, контролирующие этот признак. Сущестуют спонтанные мутации, приводящие к лекарственной устойчивости.

Приобретенная лекарственная устойчивость. Плазмидная ус-

тойчивость приобретается м/о в процессе генетического обмена. Высокая частота передачи R-плазмид обеспечивает широкое и быстрое распространение устойчивых бактерий в популяции. Селективное давление АБП – отбор и закрепление их в биоценозах. Плазмидная устойчивость может быть множественной и при этом достигать достаточно высокого уровня.

Биохимическая основа резистентности. Энзиматическая инак-

тивация АБП: ферменты бактерий разрушают активную часть антибиотиков. (β-лактамаза → устойчивость к β-лактамным антибиотикам за счет прямого расщепления β-лактамного кольца). Другие ферменты способны модифицировать активную часть молекулы АБП (энзиматическая инактивация аминогликозидов и левомицети-

57

на). Изменение проницаемости клеточной стенки для АБП или подавление его транспорта в бактериальные клетки (устойчивость к тетрациклину). Изменение структуры компонентов микроорганизмов – изменение структуры бактериальных рибосом повышает устойчивость бактерий к аминогликозидам и макролидам, а изменение структуры РНК-синтетаз – к рифампицину.

Методы определения лекарственной чувствительности. Метод диффузии в агар (метод дисков). Метод серийных разведений в жидкой питательной среде. Метод дисков позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроорганизм к препарату. Взвесь изучаемой культуры засевают газоном. Засеянные чашки подсушивают при комнатной температуре. Затем на поверхность засеянного агара пинцетом накладывают бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков. Метод серийных разведений в жидкой питательной среде. Этот метод является точным количественным методом, его применяют в научной работе.

Принципы рациональной антимикробной химиотерапии

Микробиологический принцип – выделение и идентификация возбудителя, изучение антибиотикограммы.

Фармакологический принцип – определение оптимальных доз и методов введения на основе знаний фармакокинетики и фармодинамики препарата.

Клинический принцип: выбор наиболее активного и наименее токсичного препарата; своевременное начало лечения и полный курс антибиотикотерапии; комбинированное лечение.

Эпидемиологический принцип – знание о состоянии резистентности микробных штаммов, циркулирующих в данном отделении, стационаре, регионе.

Фармацевтический принцип – соблюдение правил хранения и сроков годности препарата; создание новых химиотерапевтических средств, отличающихся механизмом антимикробного действия и мишенями; постоянная ротация (замена) используемых в данном лечебном учреждении или на определенной территории химиопрепаратов (антибиотиков).

58

Лекция 12

УЧЕНИЕ ОБ ИНФЕКЦИИ

Инфекция, или инфекционный процесс, – это совокупность фи-

зиологических и патологических восстановительно-приспособи- тельных реакций, возникающих в восприимчивом макроорганизме в результате его взаимодействия с микроорганизмом и направленных на поддержание гомеостаза.

Основные формы симбиоза: мутуализм, комменсализм, паразитизм.

Мутуализм – взаимовыгодные отношения (пример – нормальная микрофлора).

Комменсализм – выгоду извлекает один партнер (микроб), не причиняя особого вреда другому. Необходимо отметить, что при любом типе взаимоотношений микроорганизм может проявить свои патогенные свойства (пример – условно-патогенные микробы – комменсалы в иммунодефицитном хозяине).

Паразитизм – крайняя форма антагонистического симбиоза, когда микроорганизм питается за счет хозяина, т.е. извлекает выгоду, нанося при этом вред хозяину.

Инфекционный процесс. В основе инфекционного процесса лежит феномен паразитизма. Выделяют три категории паразитов: облигатные, факультативные, случайные. Сходный процесс, вызванный простейшими, гельминтами и насекомыми называется инвази-

ей.

Облигатные паразиты. Облигатные паразиты во всех стадиях популяционного цикла связаны с организмом хозяина (хламидии, риккетсии, вирусы).

Факультативные паразиты в процессе циркуляции помимо организма хозяина используют внешнюю среду. Преобладает паразитическая фаза существования.

Случайные паразиты используют внешнюю среду для их автономного обитания. Сапрофитная фаза существования для них основная и обязательная, а паразитическая – эпизодическая.

Патогенные микроорганизмы. В естественных условиях патогенные микроорганизмы должны проникать в макроорганизм через определенные входные ворота инфекции – ткани и органы. Пути и способы выделения микробов из организма, определяющие меха-

59

низм передачи и распространения микробов в макроорганизм, специфичны.

Факторы инфекционного процесса. Существует три группы фак-

торов:

количественные и качественные характеристики возбудителя инфекционного процесса;

состояние макроорганизма, степень его восприимчивости к м/о;

действие физических, химических и биологических факторов окружающей среды.

Стадии инфекционного процесса:

Первая стадия – проникновение микробов в макроорганизм – внедрение и адаптация микробов в месте входных ворот инфекции

– заражение (инфицирование), адгезия.

Вторая стадия – колонизация кожных покровов и слизистых оболочек, в месте входных ворот начинается интенсивное размножение микроорганизмов, высвобождаются продукты метаболизма м/о, их ферментов и токсинов, которые оказывают местное или отдаленное повреждающее воздействие на ткани и органы.

Третья стадия – диссеминация – распространение м/о за пре-

делы первичного очага внедрения и колонизация лимфогенным, бронхогенным, гематогенным или периневральным путем, происходит генерализация инфекционного процесса.

Четвертая стадия – мобилизация защитных факторов мак-

роорганизма – неспецифических, далее специфических факторов защиты – нейтрализация м/о, токсинов, восстановление нарушенного гомеостаза.

Пятая стадия – окончание. Возможные исходы инфекционно-

го процесса: полное выздоровление и формирование иммунитета; бактерионосительство; летальный исход; носительство в носоглотке.

Инфекционный процесс составляет основу инфекционной болезни. Инфекционная болезнь – это инфекционное состояние макроорганизма, определяемое лабораторно и/или клинически, обусловленное действием м/о и их токсинов. Инфекционная болезнь сопровождается различными степенями нарушения гомеостаза. Клинически выраженная инфекционная болезнь – это крайняя степень проявления инфекционного процесса. Инфекционный процесс не всегда заканчивается развитием болезни.

60