М. В. Бадлеева Краткий курс лекций по микробиологии

ны активно двигаться за счет псевдоподий, жгутиков или ресничек. Жизненный цикл паразитических простейших нередко включает образование промежуточных форм в различных хозяевах. Основные классы простейших: саркодовые или амебы – наиболее просто устроенные простейшие, споровики (малярийные плазмодии, токсоплазмы, пневмоцисты, бабезии), жгутиконосцы (трихомонады, лейшмании), инфузории. Простейшие очень широко распространены, достаточно сказать, что малярийными плазмодиями и токсоплазмами поражено до трети населения земного шара. Всего известно около 7 тыс. видов простейших, патогенных для различных растений, животных, человека, непатогенных – во много раз больше. Простейших изучает наука протозоология.

Основные свойства вирусов. Отмечают ультрамикроскопические размеры; содержание нуклеиновой кислоты только одного типа – ДНК или РНК; отсутствие способности к росту и бинарному делению; размножение за счет воспроизводства себя из собственного генома; отсутствие собственных систем мобилизации энергии; отсутствие способности синтеза белка. Средой обитания являются бактерии, клетки растений, животных и человека.

Структура вириона:

в центре вириона находится нуклеиновая кислота, которая окружена капсидом;

капсид состоит из белковых субъединиц, называемых капсомерами;

количество капсидов и способ их укладки строго постоянны для каждого вида вируса (вирус полиомиелита имеет 32 капсомера, аденовирус – 252).

Тинкториальные свойства бактериальных клеток

Отношение микроорганизмов (м/о) к красителям называется тинкториальными свойствами. Для изучения тинкториальных свойств и морфологии микроорганизмов важно правильное приготовление мазка из исследуемого материала или бактериальной культуры.

Тинкториальные свойства бактериальных клеток

Этапы приготовления препаратов для микроскопического исследования:

приготовление и высушивание мазка; фиксация мазка. Способы фиксации: физический; химический.

21

Методы окраски

простые (ориентировочные); сложные (дифференциальные);

Выявляют химические и структурные особенности бактериальной клетки.

При простом методе используют один краситель (метиленовый синий – 3–5 мин, фуксин – 1–2 мин).

Сложные методы окраски позволяют дифференцировать бактерии и выявлять различные структуры клеток:

окраска по Граму (универсальный метод). В зависимости от ре-

зультатов окраски все м/о делят на две группы – Грам(+) и Грам(-);

окраска по методу Циля-Нельсена – для выявления микобакте-

рии туберкулеза и проказы, имеющих большое количество липидов, воска и оксикислот в КС и цитоплазме. Бактерии кислото-, щелоче-, спиртоустойчивы;

окраска по Ожешко – для выявления спор. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактерия – в голубой цвет;

окраска по Бурри-Гинсу – для выявления капсул. Фон препарата черный, клетки – красные, капсулы – не окрашенные.

Прижизненная окраска микроорганизмов

необходима для прижизненного изучения подвижности микроорганизмов.

для изучения живой культуры используют метиленовый синий в больших разведениях (1: 10 000).

Существуют следующие методы: Метод раздавленной капли. Метод висячей капли.

Лекция 4

ХИМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА, БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ

Химические элементы, входящие в состав живой материи, можно разделить на три основные группы.

22

1.Биогенные химические элементы (С, О, N, H). На их долю

приходится 95% сухого остатка, в т.ч. 50% – C, 20% – O2, 15% – N, 10% – H.

2.Макроэлементы – P, S, Cl, K, Mg, Ca, Na. На них приходится около 5 %.

3.Микроэлементы – Fe, Cu, I, Co, Mo и др. На них приходятся доли процента, имеют важное значение в обменных процессах.

Химические элементы входят в состав различных веществ – воды, белков, липидов, нейтральных жиров, углеводов, нуклеиновых кислот. Синтез соединений контролируется генами. Многие вещества бактериальная клетка может получать извне – из окружающей среды или организма хозяина.

Важнейшие химические элементы – углерод, водород, кислород, азот. В количественном отношении вода составляет около 75-85 % массы клетки, органические (белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды) и минеральные соединения (15-25%).

Вода. Содержание воды больше в капсульных бактериях, меньше всего – в спорах. С водой вещества поступают в клетку, тем самым выводятся продукты метаболизма. Связанная вода входит в состав белков, липидов, углеводов, клеточных структур. Свободная вода принимает участие в химических реакциях, является растворителем. Вода служит дисперсной средой для коллоидов.

Белки (50-80% сухого вещества). Простые белки (протеины), сложные (протеиды: нуклео-, липогликопротеиды). Видовая принадлежность микроорганизмов зависит от количественного и качественного состава белков. В состав белков входят как обычные для эукариотов аминокислоты, так и оригинальные – диаминопимелиновая, D-аланин, D-глютанин, – входящие в состав пептидогликанов и капсул некоторых бактерий. Только в спорах находится дипиколиновая кислота, с которой связана высокая резистентность спор. Жгутики построены из белка флагеллина, обладающего сократительной способностью и выраженными антигенными свойствами. Пили (ворсинки) содержат особый белок – пилин.

Пептидную природу имеют капсулы представителей рода Bacillus, возбудителя чумы, поверхностные антигены ряда бактерий, в том числе стафилококков и стрептококков. Белок А – специфический белок S.aureus – фактор, обусловлавливающий ряд свойств этого возбудителя. Белок М – специфический белок гемолитических

23

стрептококков серогруппы А, позволяющий дифференцировать серовары (около 100), что имеет эпидемиологическое значение.

Ряд белков содержит наружная мембрана грамотрицательных бактерий, из которых 3–4 мажорных (основных) и более 10-и – второстепенных, выполняющих различные функции. Среди мажорных белков выделяют порины, образующие диффузные поры, через которые в клетку могут проникать мелкие гидрофильные молекулы.

Белки входят в состав пептидогликана, составляющего основу КС и определяющего постоянную форму бактерий и ряд их свойств. Пептидогликан содержит родо- и видоспецифические антигенные детерминанты. Он запускает классический и альтернативный пути активации системы комплемента. Пептидогликан тормозит фагоцитарную активность и миграцию макрофагов. Он способен инициировать развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Пептидогликан обладает противоопухолевым действием. Он оказывает пирогенное действие, т.е. вызывает лихорадку.

Из соединений белков с небелковыми компонентами наибольшее значение имеют липопротеиды, гликопротеиды и нуклеопротеиды.

Удивительное таинство жизни – синтез белка – осуществляется в рибосомах. Существует два основных типа рибосом – 70S (S- константа седиментации, единица Сведберга) и 80S. Рибосомы первого типа встречаются только у прокариотов. Антибиотики не действуют на синтез белка в рибосомах типа 80S, распространенных у эукариотов.

Нуклеиновые кислоты (10-30% сухого вещества). ДНК обусловливает генетические свойства микроорганизмов; РНК участвует в биосинтезе клеточных белков, содержится в ядре и цитоплазме.

Углеводы (12-18% сухого вещества): источник энергии и углерода. Из них состоят структурные компоненты клетки (клеточная стенка, капсула и др.). Углеводы встречаются чаще в виде полисахаридов, которые могут быть экзо- и эндоклеточными. Среди экзоклеточных полисахаридов выделяют каркасные (входят в состав капсул) и истинно экзополисахариды (выходят во внешнюю среду). Среди бактериальных полисахаридов многие находят медицинское применение. Декстраны – полисахариды с большой молекулярной массой, по виду напоминают слизь. 6%-ный раствор – кровезаменитель, полиглюкин. Декстрановый гель сефадекс используется в колоночной хроматографии как молекулярное сито. Эндоклеточные полисахариды – запасные питательные вещества клетки (крахмал, гликоген и др.).

24

Липополисахарид (ЛПС) – один из основных компонентов клеточной стенки грамотрицательных бактерий, это соединение липида

сполисахаридом. ЛПС состоит из комплекса:

1.Липид А.

2.Одинаковое для всех грамотрицательных бактерий полисаха-

ридное ядро.

3.Терминальная сахаридная цепочка (О – специфическая боко-

вая цепь).

Синонимы ЛПС – эндотоксин, О-антиген. ЛПС выполняет две основные функции: определяет антигенную специфичность и является одним из основных факторов патогенности. Токсические свойства проявляются преимущественно при разрушении бактериальных клеток. Его токсичность определяется липидом А. ЛПС запускает синтез более 20-й биологически активных веществ, определяющих патогенез эндотоксикоза, обладает пирогенным действием.

Липиды (0,2-40% сухого вещества). Входят в состав ЦПМ и КС; участвуют в энергетическом обмене. В клетке они представлены в виде нейтральных жиров, жирных кислот, фосфолипидов. Липиды, связываясь с углеводами и белками, образуют сложный комплекс, определяющий токсические свойства микроорганизмов. В состав липидов входят различные жирные кислоты, весьма специфичные для разных групп микроорганизмов. Их определение имеет в ряде случаев диагностическое значение, например у анаэробов, микобактерий.

У микобактерий туберкулеза в составе липидов имеется ряд кислотоустойчивых жирных кислот – фтионовая, миколовая и др. Высокое содержание липидов и их состав определяют многие свойства микобактерий туберкулеза: устойчивость к кислотам, щелочам и спиртам; трудная окрашиваемость красителями; устойчивость возбудителя к солнечной радиации и дезсредствам; патогенность.

Тейхоевые кислоты встречаются в клеточных стенках грамположительных бактерий. Представляют собой водорастворимые линейные полимеры, содержащие остатки глицерина или рибола, связанные фосфодиэфирными связями. С тейхоевыми кислотами связаны главные поверхностные антигены ряда грамположительных бактерий.

Минеральные вещества (2-14% сухого вещества) – Р, Na, K, Mg, S, Fe, Cl и др.

Р входит в состав нуклеиновых кислот, фосфолипидов, многих ферментов, АТФ.

25

Na участвует в поддержании осмотического давления в клетке.

Mg входит в состав рибонуклеата магния, который локализован на поверхности грамположительных бактерий.

Fe содержится в дыхательных ферментах.

Лекция 5

ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ

Физиология изучает жизненные функции бактерий: питание, дыхание, рост и размножение. В основе физиологических функций лежит непрерывный обмен веществ (метаболизм).

Обмен веществ – метаболизм – состоит из двух процессов: асси-

миляции (анаболизм) и диссимиляции (катаболизм). Процесс асси-

миляции – усвоение питательных веществ и использование их для синтеза клеточных структур (конструктивный обмен). Процесс диссимиляции – расщепление и окисление питательных веществ с синтезом АТФ, выделением энергии, необходимой для жизнедеятельности клетки (энергетический обмен). Все метаболические процессы совершаются с участием ферментов.

Питание бактерий

Особенности питания бактерий:

поступление питательных веществ через всю поверхность микробной клетки;

высокая скорость метаболических процессов;

способность быстро адаптироваться к изменяющимся условиям среды обитания.

По усвоению углерода м/о делятся на 2 типа: аутотрофы могут использовать для построения своих клеток неорганический углерод

ввиде СО2; гетеротрофы нуждаются в готовых органических соединениях: они могут усваивать углерод из углеводов, многоатомных спиртов, органических кислот, аминокислот и др. Гетеротрофы

всвою очередь делятся на сапрофиты и паразиты: сапрофиты получают готовые органические соединения от отмерших организмов (бактерии гниения), паразиты – за счет органических веществ живой клетки растений, животных или человека (риккетсии, вирусы и некоторые простейшие).

26

По усвоению азота микроорганизмы делятся на 2 группы: аминоавтотрофы: для синтеза белка используют молекулярный азот воздуха (клубеньковые бактерии, азотобактер) или усваивают его из аммонийных солей; аминогетеротрофы: получают азот из органических соединений – аминокислот, сложных белков (патогенные м/о, большинство сапрофитов).

Энергия запасается бактериальной клеткой в форме молекул АТФ. Выделяют фототрофы (источником энергии для них является свет); хемотрофы (энергию получают за счет окислительновосстановительных реакций).

По типу дыхания микроорганизмы делятся на: Облигатные (строгие) аэробы; Облигатные анаэробы;

Факультативные (необязательные) анаэробы.

Облигатные аэробы (микобактерии туберкулеза) – для их жизнедеятельности необходим свободный кислород. Реакции окисления идут при участии молекулярного кислорода с высвобождением большого количества энергии.

Облигатные анаэробы (клостридии столбняка, ботулизма и др.) способны жить и размножаться только при отсутствии свободного кислорода. Дыхание происходит путем ферментатизации субстрата с образованием небольшого количества энергии.

Факультативные анаэробы могут размножаться как при наличии кислорода, так и без него (большинство патогенных и сапрофитных бактерий).

Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов.

1.Физический – откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще – N2 – 85%, CO2 – 10%, H2 – 5%).

2.Химический – применяют химические поглотители кислоро-

да.

3.Биологический – совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов).

4.Смешанный – используют несколько разных подходов. Необходимо отметить, что создание оптимальных условий для

строгих анаэробов – очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание безкислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без содержания раство-

27

ренного кислорода, поддержание необходимого окислительновосстановительного потенциала питательных сред, взятие и доставка, посев материала в анаэробных условиях.

Существует ряд приемов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробов – предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы для создания анаэробных условий – анаэростаты. Однако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система «Газпак» со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях.

Рост и размножение бактерий. Рост – увеличение размеров от-

дельной особи и упорядоченное воспроизведение всех клеточных компонентов и структур. Размножение – способность микроорганизмов к самовоспроизведению. Основной способ размножения: поперечное деление. Сначала идет удвоение молекул ДНК. Каждая дочерняя клетка получает копию материнской ДНК. Процесс деления считается законченным, когда цитоплазма дочерних клеток разделена перегородкой.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде:

фаза 1 – исходная стационарная или лаг-фаза: адаптация клеток к питательной среде, повышение интенсивности обменных процессов, увеличение размера клетки. К концу фазы бактерии начинают размножаться;

фаза 2 – логарифмического роста: интенсивное размножение

– возрастание количества клеток в геометрической прогрессии;

фаза 3 – стационарная: количество клеток остается постоянным, т.к. число вновь появившихся клеток почти равно числу отмирающих клеток;

фаза 4 – отмирание: снижение жизнеспособности клеток, и их гибель. Причины: истощение питательной среды, накопление в ней вредных продуктов метаболизма, снижение количества молодых клеток.

28

Лекция 6

ФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА БАКТЕРИЙ.

ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ В БАКТЕРИАЛЬНУЮ КЛЕТКУ

Ферменты бактерий. Метаболизм бактерий обусловлен ферментами. Существует 6 классов ферментов бактерий:

1)оксидоредуктазы: катализируют окислительно-восстанови- тельные реакции;

2)трансферазы: осуществляют реакции переноса групп атомов;

3)гидролазы: осуществляют гидролитическое расщепление различных соединений;

4)лигазы или синтетазы: обеспечивают соединение 2-х молекул, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи в молекуле АТФ или аналогичного трифосфата;

5)лиазы: катализируют реакции отщепления от субстрата химической группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или присоединения химической группы к двойным связям;

6)изомеразы: определяют пространственное расположение групп элементов.

В соответствии с механизмами генетического контроля у бактерий выделяют 3 группы ферментов:

конститутивные, синтез которых происходит постоянно;

индуцибельные, синтез которых индуцируется наличием субстрата;

репрессибельные, синтез которых подавляется избытком продукта реакции.

Эндоферменты – ферменты, образуемые бактериальной клеткой, могут локализоваться внутри клетки. Обеспечивают бактерии доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии.

Экзоферменты – ферменты, образуемые бактериальной клеткой и выделяющиеся в окружающую среду. Гидролазы – экзоферменты, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Экзоферменты – гиалуронидаза, коллагеназа и другие ферменты агрессии. Некоторые ферменты локализованы в периплазматическом пространстве бактерий, участвуют в процессах переноса веществ в бактерию.

29

Ферментативный спектр – таксономический признак

Транспорт веществ в бактериальную клетку. Существует два типа переноса веществ в бактериальную клетку: пассивный и активный. При пассивном переносе вещество проникает в клетку только по градиенту концентрации. Затраты энергии при этом не происходит. Различают две разновидности пассивного переноса: простую диффузию и облегченную диффузию.

Простая диффузия – неспецифическое проникновение веществ в клетку, при этом решающее значение имеет величина молекул и липофильность. Скорость переноса не значительна. Облегченная диффузия протекает с участием белка-переносчика. Скорость этого способа переноса зависит от концентрации вещества в наружном слое.

Активный транспорт веществ в клетку. При активном переносе вещество проникает в клетку против градиента концентрации при помощи белка-переносчика – пермеазы. При этом происходит затрата энергии. Имеется два механизма активного транспорта.

Механизмы активного транспорта веществ в клетку. Активный транспорт: небольшие молекулы (аминокислоты, сахара) «накачиваются» в клетку, создается концентрация в 100-1000 раз выше, чем снаружи клетки. Второй механизм – транслокация радикалов,

обеспечивает транспорт сахаров (глюкоза, фруктоза). В процессе переноса происходит химическая модифиция – фосфорилирование. Для осуществления активного транспорта в бактерии имеется специальная фосфотрансферная система.

Фосфотрансферная система. Составной частью этой системы является активный фосфорилированный белок-переносчик (АФБ). АФБ связывает свободный сахар на наружной поверхности ЦПМ, транспортирует его в цитоплазму, где сахар освобождается в виде фосфата. Далее фосфаты вступают в цепь биохимических реакций, в результате образуются АТФ и ингредиенты для биосинтеза компонентов клетки. Это называется конструктивным метаболизмом.

Энергетический метаболизм. Типы метаболизма: окислитель-

ный, или дыхание; бродильный, или ферментативный; смешанный. Пути расщепления глюкозы при использовании ее в качестве ис-

точника углерода и энергии:

через образование фруктозо-1,6-дифосфата (ФДФ-путь). Выход: 2 молекулы пирувата, 2 молекулы АТФ, 2 молекулы восстановленного НАД;

30