Лабораторный практикум Рекомендации студентам при подготовке к занятию

Лабораторные работы выполняются в лабораторной тетради, ведение которой является обязательным. Каждая работа предварительно оформляется, заранее выполняется часть работы, предусмотренная заданием темы. На занятии осуществляется опрос по теоретическим вопросам, выполняется практическая часть заданий, заносятся поправки и рисунки, пишутся выводы по теме занятия.

Работа считается выполненной, если она защищена студентом и подписана преподавателем.

Студенты, успешно выполнившие все лабораторные работы, допускаются к сдаче зачета.

Лабораторная работа 1. Правила работы в микробиологической лаборатории. Основы техники микроскопии с микробиологическими объектами.

Иммерсионные объективы и правила работы с ними. Приготовление препаратов фиксированных клеток микроорганизмов.

Материал и оборудование: предметные стекла, спиртовки, бактериологические петли, вода дистиллированная, колбы с водой, кристаллизаторы с подставками, наборы красителей, культуры микроорганизмов на косых срезах в пробирках, микроскопы, объективы иммерсионные, иммерсия (кедровое масло), плакаты по теме.

Цели занятия:

1. Изучить правила работы в микробиологической лаборатории, правила ТБ и ОТ, правила работы с культурами микроорганизмов.

2. Повторить устройство микроскопа и изучить правила работы с иммерсионным объективом.

3. Освоить методику приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов и уметь определить морфологический тип клеток микроорганизмов и характер их расположения.

Задание 1.1

Запишите в тетрадь основные правила работы и ТБ в микробиологической лаборатории. Изучите правила работы с культурами микроорганизмов.

Задание 1.2

Изучите правила работы с иммерсионным объективом, запишите их в тетрадь, укажите преимущества иммерсионной системы. Дайте краткую характеристику типам микроскопии.

Задание 1.3

Изучите методику приготовления препаратов фиксированных клеток, запишите основные этапы: приготовление мазка; высушивание; фиксация и окраска; опишите технику этих этапов и значение. Отработайте некоторые отдельные приемы.

Приготовьте фиксированный препарат и рассмотрите его под малым и большим (иммерсионным) увеличением. Зарисуйте препарат, укажите тип клеток по морфологии и расположению. Определите присутствие эндоспор.

Лабораторная работа 2. Техника микроскопирования микробиологических объектов: приготовление препаратов живых клеток микроорганизмов. Движение микроорганизмов.

Цели занятия:

1. Изучить: способы и типы движения микроорганизмов; особенности строения органов и структур движения микроорганизмов.

2. Изучить методику приготовления прижизненных препаратов и научиться готовить препараты живых клеток микроорганизмов.

3. Повторить правила работы с микроскопом с сухими объективами, рассмотреть приготовленные препараты, определить характер движения клеток.

Задание 2.1

Изучите тему «Движение микроорганизмов». Запишите в тетраде типы движения бактерий, зарисуйте схему: строения жгутика и строение (схематическое) спирохеты. Укажите, какие кольца имеет базальная структура и где они расположены в стуктуре клеточной оболочки (Г+; Г-).

Задание 2.2

Запишите методы «раздавленной капли» и метод «висячей капли» для приготовления «прижизненных» препаратов. Запишите методику получения накопительной культуры сенной и картофельной палочки. Используя суточные культуры сенной палочки, приготовьте препараты живых клеток микроорганизмов.

Задание 2.3

Рассмотрите приготовленные препараты при малом и большом увеличении. Найдите наилучшие объекты и определите характер и тип движения. Увиденное зарисуйте, отметив увеличение, характер и тип движения.

Задание 2. 4

Рассмотрите извитые формы, используя инкубированный настой навозной жижи. Приготовьте фиксированный и окрашенный фуксином препарат. Рассмотрите препарат как демонстрационный, определите тип клеток, зарисуйте типы извитых клеток микроорганизмов.

Лабораторная работа 3. Цитохимические методы изучения клеток микроорганизмов. Дифференциальные способы окраски клеток прокариот. Методы выявления эндоспор и капсул. Окраска по Граму.

Цели занятия:

1. Используя знания о структурной организации клетки прокариот выяснить сущность и причины дифференциации клеток по методу Грама.

2. Научиться использовать методику Грама, отработать технику микроскопирования с иммерсионным объективом.

3. Изучить тему «Рост и размножение микроорганизмов».

4. Изучить биологическое значение, строение спор и основные этапы и способы спорообразования у спорообразующихся бактерий.

5. Выяснить структуру и химический состав капсул, биологический смысл капсулообразования, функции слизистых образований.

6. Научиться использовать методы выявления спор и капсул и отработать навыки работы с микроскопом.

Оборудование: предметные стекла, спиртовки, кристаллизаторы, петли бактериологические, наборы красителей, вода дистиллированная в стерильных пробирках, вода в колбах, культуры микроорганизмов (предположительно Грамположительных и Грамотрицательных), культуры спорообразующих бактерий, культуры рода Азотобактер на чашках Петри, микроскопы.

Задание 3.1

Повторить структуру и химический состав оболочек клеток грациликутных и фирмакутных бактерий. Зарисовать в тетради схемы строения оболочек прокариот, укажите вещества оболочек.

Задание 3.2

Изучите методику окраски клеток по Граму, запишите последовательность операций. Сделайте вывод о причинах различной окраски по этому методу.

Выполните на предметном стекле два мазка разных культур микроорганизмов и окрасьте их по Граму. Рассмотрите препараты с иммерсией, увиденное зарисуйте. Укажите тип клеток по Граму, морфологию клеток. Запишите вывод, указав причины разной окраски клеток.

Задание 3.3

Зарисуйте схему строения эндоспоры, типы эндоспор.

Изучите метод выявления спор по Пешкову, запишите его в тетрадь. Выполните окраску мазков исследуемых культур, рассмотрите с иммерсией. Укажите отличие эндоспор и вегетативных клеток на препарате. Зарисуйте препарат, напишите вывод.

Задание 3.4

Запишите известные способы выявления капсул, изучите их строение и биологическое значение.

Проведите выявление капсул у почвенных бактерий рода Азотобактер методом позитивного и негативного контрастирования. Рассмотрите на большом увеличении (без иммерсии!) с сухими объективами.

Литература: Микробиология с основами вирусологии. Методические указания для лабораторных занятий. Т.М. Царенко. – Витебск. Изд-во ВГУ. 1999.

Лабораторная работа 4. Метаболизм прокариот.

Цели и задачи темы:

1. Изучить основные особенности энергетического и конструктивного метаболизма прокариотических микроорганизмов.

2. Рассмотреть основные типы брожения, выяснить особенности путей превращения глюкозы.

3. Изучить характерные черты различных групп микроорганизмов, осуществляющих разные типы брожения.

4. Научиться выделять и микроскопировать бактерии молочнокислого брожения, уксуснокислых и маслянокислых бактерий в продуктах питания и других субстратах.

Оборудование: наборы для микробиологических исследований (см. ранее), кефир, капустный и огуречный рассол, культура прокисшего пива, культура «крапивные снопики» и картофельной палочки.

Задание 4.1

Микроскопирование молочнокислых бактерий молочных продуктов и продуктов квашения (силосования). Записать способы выделения и микроскопирования молочнокислых бактерий и их основные виды и характеристики. Зарисовать препараты.

Методика микроскопирования молочнокислых бактерий. Готовят препарат из прокисшего молока. Петлю вводят в сгусток и повернув вокруг оси, извлекают, прикасаясь ею и к пленке. Сгусток размазывают на предметном стекле очень тонким слоем без воды. Сушат на воздухе. Фиксируют смесью спирта с эфиром (1:1) несколько раз, нанося смесь на мазок не сливая ее.

Фиксированный препарат окрашивают метиленовой синькой 2–3 мин, промывают водой, высушивают, и микроскопируют с иммерсией. Обнаружить: Streptococcus lactis, Lactoвacillus acidophilus и молочную плесень – Geotrichum candidum.

Характеристика таксономических групп гомоферментативных молочнокислых бактерий (Г-положительных, не образуют спор, неподвижны) (табл. 10).

Таблица 10

Род и подрод бактерий, виды	Морфология и особенности деления	Молярное содержание ГЦ в ДНК	Конфигурация молочной к-ты
Streptococcus	Сферические, овальные делятся в одной плоскости, образуют пары или цепочки	33–34	D
p. Pediococcus p. Cerevisiae	Кокки делятся в двух плоскостях, образуются тетрады клеток	32–34	DL
p.Lactobacil-lus	Палочки; делятся в одной плоскости, образуют пары или цепочки клеток	32–46	L

L. plantarum – осуществляют гетероферментативное молочнокислое брожение.

65–90% сахаров – в молочную кислоту, продуцируют DL – формы молочной кислоты (лактатдегидрогеназа), 02 – не включен в энергетический обмен, есть защита от 02.

– слабо развиты биосинтетические возможности;

– ауксотрофность;

– примитивность конструктивного метаболизма;

– находятся на начальном этапе эволюции;

– распространены: там, где могут обеспечить себя питательными веществами: на поверхности органических остатков, на слизистых оболочках пищеварительного тракта.

– Простокваша – Streptococcus lactis (в Болгарии) – Lactobacillus bulgaricus;

– ацидофилин – Lactobacillus acidophilus, кефир – бактерии + дрожжи (Geotrichum candidum);

–метиленовый синий.

Гомоферментативное молочнокислое брожение (суммарная реакция) – глюкоза + Фн + 2 АДФ – образуют 2 молекулы молочной кислоты +2АТФ+ 2Н₂О.

Задание 4.2

Выделение и микроскопирование уксуснокислых бактерий род Ацетобактер из пленки, образовавшейся на пиве. Записать последовательность операций, характеристику уксуснокислого брожения. Окрашивать фуксином. Записать характеристику и зарисовать вид микроорганизмов рода Ацетобактер.

Выделение уксуснокислых бактерий.

В конические колбы (на 100–150 мл) наливают слоем 0,5–1,0 см пиво, колбы закрывают ватными пробками и ставят в термостат при – 30 С на 5–6 суток.

Приготовить мазок из пленки, образовавшейся на поверхности. Окраска фуксином. Фиксация над пламенем спиртовки.

Задание 4.3. Микроскопирование маслянокислых бактерий.

Из пробирки с культурой картофельной палочки пипеткой из среднего слоя жидкости берут пробу, наносят на предметное стекло. Добавляют каплю р-ра Люголя и рассматривают под иммерсией. Обнаруживают крупные клетки клостридий.

Сине-фиолетовое окрашивание клеток обусловлено гранулезой. Записать и изучить характеристику рода Клостридий.

Выделение маслянокислых бактерий.

Сырой неочищенный картофель нарезают тонкими длинными ломтиками и раскладывают в пробирки, в которые предварительно насыпают 0,5–1,0 г мела. Заливают на 2/3 водопроводной водой. Выдерживают на водяной бане при температуре 80°С 15–20 мин.

Почвенную смесь 1:100 доводят до кипения и затем по 1 мл вносят в каждую пробирку.

Пробирки ставят в термостат при температуре 28–30°С. Количество пробирок по числу студентов.

Задание 4.4. Микроскопирование возбудителей брожения пектиновых веществ.

Извлекают снопик из пробирки, берут из середины его несколько соломинок и выжимают из них немного жидкости на предметное стекло, добавляют каплю р-ра Люголя, микроскопируют под иммерсией.

Найдите крупные палочковидные бактерии с плектридиальным типом спорообразования (барабанная палочка), и прерывистым расположением гранулезы (Clostridium pectinovorum).

Более мелкие сигарообразные палочки (Clоstridium felsineum) со спорой на конце, гранулеза заполняет всю вегетативную клетку.

Выделение возбудителей брожения пектиновых веществ

Из стеблей крапивы готовят снопики (по 2–3 стебля) и перевязывают ниткой в 2-х местах, длина снопика 3–4 см.

Снопики помещают в колбу, заливают водопроводной водой и кипятят 2 мин. Воду сливают и снова кипятят. Затем раскладывают снопики в пробирки, заливают на 2/3 объема водой, добавляют небольшое количество мела.

В каждую пробирку вносят по 1 мл почвенной болтушки (1:100) предварительно доводят до кипения. Пробирки помещают в термостат при температуре (28-30°С) Количество пробирок по числу студентов.