В некоторых случаях возникает необходимость одновременного выявления нескольких антигенов. В этом случае можно следовать двум разным стратегиям. Первая основана на последовательном выявлении антигенов и применяется тогда, когда возможны перекрестные реакции или используются первичные антитела на основе одних и тех же иммуноглобулинов. В этом случае приходится полностью проводить окрашивание, получать изображения, затем тщательно отмывать препарат и проводить реакцию с другими антителами. Этот путь наименее результативен и неудачи возможны не только из-за недостаточной отмывки, но и вследствие слишком тщательной отмывки, вплоть до полной потери препаратов. В случае возможных кросс-реакций первичных антител, полученных в разных организмах, проводят последовательные окраски. Коммерческие вторичные антитела редко имеют сродство друг к другу (это можно уточнить в описании производителя) и поэтому окраску ими можно проводить одновременно.

Во втором случае, когда все используемые антитела имеют высокую специфичность и не связываются друг с другом, возможно проведение одновременного окрашивания первичными, а затем одновременное окрашивание вторичными антителами. Следует напомнить, что используемые иммуноглобулины должны не только быть разного происхождения, но и нести флуорохромы с не перекрывающимися спектрами излучения.

Кроме потребности в совмещении нескольких иммуноцитохимических реакций, довольно часто возникает необходимость одновременного использования других методов исследования. Здесь решающим фактором является сохранность антигенных свойств. Поэтому окраску антителами проводят непосредственно после фиксации. То есть до нее могут быть проведены только прижизненные манипуляции, а все остальные методы исследования можно применять после иммунохимической окраски. Если необходимо дополнительно окрасить препарат флуоресцентными красителями, окрашивание проводят перед заключением препарата. При использовании длительных методик, связанных с многократным высушиванием препарата, целесообразно сначала исследовать его под микроскопом, сохранить полученные изображения, а уже потом проводить последующие обработки. Независимо от того, будете ли вы смотреть препарат в один прием или в несколько, все используемые флуорохромы не должны иметь перекрывающиеся спектры излучения.

Готовые препараты лучше исследовать сразу, однако их можно хранить некоторое время в горизонтальном состоянии в темных коробочках при –20оС.

2.4. Включение меченых предшественников в реплицирующуюся ДНК

Включение галогенизированных предшественников в реплицирующуюся ДНК позволяет получать препараты метафазных хромосом с высоким разрешением (Протокол 2.4.1), исследовать репликационный бэндинг хромосом (Протокол 2.4.2.), а также проводить исследования временных особенностей репликации различных хроматиновых фокусов. В основе этих методов лежит способность клеток усваивать галогенизированные нуклеотидтрифосфаты из питательной среды и включать их в состав синтезирующейся ДНК. В зависимости от срока и длительности инкубации, а также от способов визуализации меченной ДНК, можно получать различные результаты.