7.Нанести 10 мкл реакционной смеси, содержащей 0,25 единиц РНКазина (ингибитора РНКаз) и 0,5 единиц ревертазы (обратной транскриптазы).

Перевернуть препарат на предметное стекло и инкубировать 90 мин при

42оС.

8.Аккуратно смыть стекло буфером RT.

9.Отмыть препарат в 2 сменах 0,5х SSC по 30 мин при 42оС.

10.Отмыть препарат в 2 сменах 0,1х SSC по 30 мин при 42оС.

11.Нанести 100мкл блокирующего раствора и инкубировать 30-40 мин при 37оС во влажной камере.

12.Стряхнуть блокирующий раствор, нанести 100 мкл детектирующего раствора и инкубировать 1 час при 37оС во влажной камере.

13.Отмывать в 4 сменах 2x SSC; 0,02% Tween 20 по 5 мин при 24о–37оС и постоянном покачивании

14.Провести по серии спиртов повышающейся концентрации и высушить на воздухе.

15.Заключить в фотозащитную среду и исследовать под микроскопом.

Этапы с 12 по 15 проводить в темноте.

2.6. Флуоресцентная гибридизация in situ

Разработанный Дж. Голлом и М.-Л. Пардью в 1969 г. на основе свойства нуклеиновых кислот комплементарно спариваться, метод гибридизации in situ позволяет точно определить локализацию практически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно в клетке или клеточном ядре, на метафазных хромосомах, растянутых хроматиновых фибриллах и микрочипах. Последние 20 лет технология гибридизации in situ интенсивно развивалась и преобразовалась в целый комплекс методов, включающих: супрессорную FISH (CISS), одновременную многоцветную FISH, FISH на растянутых фибриллах, сравнительную геномную гибридизацию (CGH), хромосомный пэйнтинг (Zoo-FISH), M-FISH (многоцветная FISH с зондами к отдельным хромосомам), межвидовое цветное сегментирование хромосом (Rx- FISH), спектральное кариотипирование (SKY), многоцветный бэндинг хромосом (MCB-FISH), 3D-FISH, а также FISH и CGH на микрочипах. Несмотря на различия отдельных методов, все они включают этапы денатурации меченого зонда и нуклеиновых кислот на препарате с последующей их одновременной ренатурацией.

Получение положительного результата зависит от сохранности нуклеиновых кислот на препарате. В первую очередь сохранность материала обеспечивает правильная обработка предметных стекол. Для давленых препаратов, мазков и спрэдов используют чистые обезжиренные стекла, отмытые в растворах детергентов и этаноле. Срезы наклеивают на стекла, обработанные поли-L-лизином или аминопропилтриэтоксисиланом (Протокол 2.6.1). Использование желатина, так же как и альбумина, в данном случае невозможно, так как они будут перевариваться протеазами во время ферментативной предобработки препаратов.