Протокол 2.2.10. Прижизненная окраска клеток в культуре

1.Вырастить монослой клеток на покровном стекле.

2.Растворить 25 мг SITC в 10 мл культуральной среды (до конечной концентрации 2,5 мг/мл).

3.Инкубировать клеточную культуру в среде с краской 48 часов.

4.Заключить монослой клеток в том же растворе SITC в среде для культивирования и исследовать под микроскопом.

В живых клетках окрашиваются цитоплазматические везикулы вокруг ядра, а у мертвых клеток флуоресцирует только мембрана. Если такой препарат зафиксировать в растворе, содержащем спирт, то краситель вымывается из цитоплазмы и интенсивно окрашивает ядро.

Протокол 2.2.11. Окраска лизосом в живых клетках

Концентрированный раствор акридинового оранжевого – 1 мг краски в 2 мл буфера Макильвейна, довести pH до 7,3 минимальным количеством HCl

или NaOH.

Рабочий раствор: 1 мл концентрированного раствора развести в 99 мл буфера Макильвейна, при необходимости довести pH до 7,3.

1.Вырастить монослой клеток на покровном стекле.

2.Отмыть клетки от культуральной среды буфером Макильвейна.

3.Инкубировать 5 мин в свежеприготовленном рабочем растворе красителя.

4.Сполоснуть несколько секунд в буфере Макильвейна, заключить препарат в том же буфере и исследовать под микроскопом.

Лизосомы живых клеток флуоресцируют оранжевым цветом. Мертвые клетки имеют ярко-красную флуоресценцию цитоплазмы и ярко-зеленую ядер.

Протокол 2.2.12. Прижизненная окраска митохондриальной ДНК в клетках дрожжей

1.Подготовить раствор DAPI (1,0 мкг/мл) на питательной среде для выращивания клеток.

2.Инкубировать клетки в растворе красителя на предметном стекле.

3.Исследовать под микроскопом.

Ярко флуоресцируют многочисленные митохондрии в цитоплазме. Отдельные клетки имеют слабо окрашенные ядра.

Использование флуоресцирующих конъюгатов липополисахаридов и декстрансульфата позволяет проводить прижизненное исследование эндоцитоза. Хотя в данном случае никакого окрашивания не происходит, наблюдение за флуоресцирующими частицами различных размеров позволяет следить за динамикой внутриклеточных процессов.