среде с 10мкМ содержанием BrdUTP, IdUTP или CldUTP. Монослой клеток фиксируют на покровных стеклах или делают препараты метафазных хромосом (Протокол 2.6.2). Поскольку иммунохимическое выявление галогенизированных предшественников требует проведения предварительной денатурации ДНК, целесообразно проводить их окрашивание после проведения гибридизации. Причем при осуществлении совместной иммунохимической детекции все процедуры лучше проводить в PBS, так как антитела против галогенизированных предшественников могут плохо работать в SSC. Также, можно сначала полностью закончить все процедуры, связанные с детекцией FISH, а затем перейти к окрашиванию включенных предшественников (Раздел

2.4).

Кроме того, для контрастирования и визуализации объектов проводят дополнительную окраску препаратов флуоресцентными красителями (Протоколы 2.2.8 и 2.2.9). Такие окраски проводят после завершения всех процедур и перед заключением готового препарата в фотозащитный раствор.

Готовые препараты рекомендуется хранить в темном прохладном месте до исследования под микроскопом. При необходимости длительного хранения их надо аккуратно сложить в коробочки, избегая сдвигов покровных стекол, и убрать в морозильную камеру на –20оС. Опыт показывает, что при таком хранении флуоресцентный сигнал на препарате сохраняется в течение многих месяцев.

2.7. Флуоресцирующие белки

Клонирование в 1962 г. зеленого флуоресцирующего белка (GFP) из светоизлучающего органа медузы Aequorea victoria открыло новые возможности для использования флуоресцентной микроскопии. Примечателен тот факт, что для упаковки белковой молекулы, обладающей способностью флуоресцировать, не требуется никаких уникальных факторов, присущих только биолюминесцирующей медузе. Благодаря этому GFP удается успешно экспрессировать в чужеродных системах, а также создавать на его основе слитные белковые конструкции, сохраняющие свойства составляющих их элементов.

При создании успешно работающих слитных конструкций важно учитывать тот факт, что молекула GFP имеет сложную пространственную организацию, поэтому между участком аминокислотной последовательности, представляющей собой GFP (флуоресцентный домен), и исследуемым белком вставляют связующую (линкерную) последовательность. Главное требование к такому линкеру – гибкость, т.е. он должен служить шарниром между двумя функционально независимыми доменами; при этом слишком длинный линкер может нарушить функциональность белков, кроме того, он может оказаться ломким или послужить мишенью для клеточных протеаз. Наиболее часто применяются линкеры, состоящие из нескольких остатков глицина, они имеют маленькую длину и очень высокую подвижность, однако такой участок обладает ярко выраженными гидрофобными свойствами. Чтобы увеличить растворимость связующей последовательности и при этом сохранить гибкость, используют линкеры, состоящие из чередующихся остатков глицина и серина.

Для экспрессии слитных белков используются трансляционные векторы, соответствующие объекту исследования. Кроме того, получены линии трансгенных клеток, а также некоторые организмы, несущие гибридные гены, кодирующие GFP слитный с тем или иным белком. Такие системы позволяют