Планируя эксперимент необходимо учесть, что для локализации трех последовательностей достаточно использовать две различные репортерные системы. То есть первый зонд детектируется флуорохромом 1, второй зонд – флуорохромом 2, а третий зонд – одновременно флуорохромами 1 и 2. Такой подход не только снижает стоимость эксперимента, но и позволяет получать более четкие результаты, поскольку увеличение числа флуорохромов приводит к тому, что возникает проблема частичного перекрывания спектров. Число различных последовательностей, которые одновременно можно локализовать на препарате, равно 2n-1, где n – число использованных флуорохромов. Так, имея 3 репортерных молекулы, мы можем получить 7 различных зондов.

При наличии в комплектации микроскопа узкополосных фильтров можно использовать одновременно и большее количество зондов. Так использование пяти флуорохромов (например, AMCA, FITC, Cy3, Cy5, Cy7) дает возможность создать 31 независимый зонд. Классическая схема M-FISH, позволяющая идентифицировать все хромосомы человека, основана на одновременном использовании 6 флуорохромов (Таблица 2.2).

Таблица 2.2. Схема M-FISH на хромосомах человека с 6 флуорохромами

Другой способ обойти проблему перекрывающихся спектров – проведение нескольких последовательных гибридизаций на одном препарате с промежуточными фиксациями изображений и отмывками. Такой метод получил название репробинга. Он позволяет, используя ограниченное число флуорохромов, локализовать достаточно много различных последовательностей. Ниже приведена схема эксперимента для идентификации всех хромосом человека с использованием всего трех флуорохромов (Таблица

2.3).

Таблица 2.3. Схема идентификации хромосом человека методом репробинга с 3 флуорохромами

При необходимости, гибридизацию in situ можно сочетать с другими методами исследования. Иммуноцитохимическое окрашивание белков проводят либо до гибридизации, либо после нее, вместе с детекцией гаптенов, в зависимости от чувствительности эпитопов к высушиванию.

Также метод FISH можно сочетать с включением галогенизированных предшественников. Само мечение проводят инкубацией клеток культуры в