2.3. Иммуноцитохимия

В основе метода лежит способность антител специфически связываться с определенными веществами в клетках и тканях на препаратах. В отличие от гистохимических методов, использование антител позволяет достичь значительно более высокой точности распознавания для тех или иных веществ. Однако внедрение иммуноцитохимических методов в практику стало возможно только после того, как удалось разработать способы конъюгации молекул красителя с антителами без нарушения их иммунных свойств.

С 30-х годов прошлого столетия метод претерпел несколько этапов развития и стал значительно точнее и эффективнее. В настоящее время исследователь может использовать не только высоко-специфичные афинноочищенные моноклональные антитела вместо поликлональных антисывороток, но и F(ab’)2 фрагменты иммуноглобулинов, состоящие из вариабельных частей легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов. Такие укороченные молекулы более специфично связываются с мишенью на препарате и меньше подвержены деградации.

При осуществлении непрямого метода иммуноцитохимического окрашивания используют антитела против исследуемого белка, полученные в результате иммунизации того или иного животного. А они уже специфически распознаются меченными флуорохромами антителами против иммуноглобулинов того животного, в котором были выработаны первые антитела (Рисунок 2.1). В случае прямого метода используют антитела против исследуемого вещества непосредственно конъюгированные с репортерными молекулами (Рисунок 2.1, А). Подходы, аналогичные иммуноцитохимическим, могут применяться и с другими реактивами, обладающими высокой специфичностью распознавания. Например, авидин из яичного белка и стрептавидин, выделенный из Streptomyces avidinii, обладают высоким сродством к биотину, а яд бледной поганки фаллоидин очень специфично распознает фибриллярный актин.

флуорохром

III антитело

флуорохром

II антитело

флуорохром

I антитело

антиген

Рисунок 2.1. Схемы экспериментов прямого (А) и непрямого (Б и В) методов.

При проведении иммуноцитохимического окрашивания часто возникает риск неспецифических реакций. Это может происходить потому, что разные белки могут иметь одинаковые или сходные эпитопы, распознающиеся антителами. Кроме того, при нарушении условий хранения (многократных размораживаниях и замораживаниях, бактериальном заражении) антитела разрушаются и начинают неспецифически оседать на препарате. Неспецифическая адсорбция антител может происходить также при

использовании слишком высоких концентраций. Чтобы этого не происходило, необходимо провести серию пробных реакций на препаратах, содержащих исследуемый антиген, используя последовательные разведения антител. Разведение подбирают таким образом, чтобы неспецифическое окрашивание было минимально, в то время как специфическое было достаточно интенсивно.

Коммерческие антитела необходимо хранить согласно инструкции производителя. В случае использования антисывороток в них добавляют азид натрия или тимерозол до 0,02% и хранят при 4оС, можно также добавить в них равный объем глицерина – тогда сыворотку можно будет хранить при -20оС, но только до первого размораживания. Как коммерческие, так и некоммерческие антитела можно размораживать только один раз, а после этого их можно хранить непродолжительное время при 4оС. Поэтому удобнее сразу расфасовать все имеющиеся антитела на отдельные порции, достаточные для использования один или несколько раз.

Неспецифическая реакция может быть связана также с неправильной фиксацией и хранением препарата. Независимо от метода приготовления препаратов и используемых фиксаторов, препараты во время проведения иммуноцитохимических реакций нельзя высушивать, особенно до осуществления соответствующих отмывок. К сожалению, невозможно порекомендовать один фиксатор для всех возможных иммуноцитохимических реакций. Выбор фиксатора главным образом зависит от влияния того или иного реактива на антигенные свойства исследуемого белка. Иными словами при использовании разных антител, возможно, придется следовать разным стратегиям фиксации препарата.

Традиционно используются фиксаторы на основе формалина, хлороформа, ацетона, спиртов, уксусной кислоты (Таблица 2.1), при этом для сохранности антигена лучше готовить мазки, давленые препараты, разного рода спрэды и замороженные срезы, чем проводить реакцию на регидратированных парафиновых срезах. Кроме того, кратковременная фиксация всегда предпочтительнее, особенно это касается формалиновых фиксаций, поскольку при длительном хранении из-за возникновения в белковых молекулах поперечных сшивок появляется сильная автофлуоресценция тканей (Раздел 2.1), затрудняющая интерпретацию результатов. При исследовании эпитопов, изменяющих антигенные свойства при высыхании, нельзя использовать фиксаторы на основе ацетона, в таком случае лучше использовать этанол различных концентраций. Иногда предпочтительнее использование метанола, однако в каждом случае фиксатор придется подбирать экспериментально. Приготовленные препараты лучше использовать как можно быстрее, однако иногда их можно хранить некоторое время в буферном растворе с 0,01% азидом натрия или же в 70% этаноле или метаноле. А в том случае, когда возможно использование высушенных препаратов, их можно хранить при –20оС, не допуская обводнения.