А.Ф.Сайфитдинова

67

Оглавление

ПРЕДИСЛОВИЕ.......................................................................................................................

1

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .........................................................................................................

2

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ ВО ФЛУОРЕСЦЕНТНУЮ МИКРОСКОПИЮ............................................

3

1.1. Флуорохромы.....................................................................................................

3

Протокол 1.1.1. Фотозащитная среда 1........................................................

4

Протокол 1.1.2. Фотозащитная среда 2........................................................

4

Протокол 1.1.3. Фотозащитная среда 3........................................................

5

Протокол 1.1.4. Фотозащитная среда 4........................................................

5

1.2. Флуоресцентный микроскоп.............................................................................

5

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДВУМЕРНОЙ

ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ......................................................................................

8

2.1. Автофлуоресценция...........................................................................................

8

2.2. Методы окраски препаратов флуоресцирующими красителями..................

8

Протокол 2.2.1. Окраска липидов водным раствором фосфина 3R.......

8

Протокол 2.2.2. Окраска нуклеиновых кислот акридиновым

оранжевым........................................................................................................

9

Протокол 2.2.3. Q-бэндинг митотических хромосом с акрихином.........

9

Протокол 2.2.4. Q-бэндинг митотических хромосом с акрихин ипритом

...........................................................................................................................

10

Протокол 2.2.5. Дифференциальная окраска хромосом хромомицином

А3 ......................................................................................................................

10

Протокол 2.2.6. Окраска хромосом хромомицином А3/дистамицином А

...........................................................................................................................

11

Протокол 2.2.7. Окраска АТ-обогащенной ДНК на препаратах

хромосом..........................................................................................................

11

Протокол 2.2.8. Окраска нуклеиновых кислот различными

флуорохромами..............................................................................................

11

Протокол 2.2.9. Совмещенная с заключением окраска нуклеиновых

кислот...............................................................................................................

12

Протокол 2.2.10. Прижизненная окраска клеток в культуре ...............

13

Протокол 2.2.11. Окраска лизосом в живых клетках.............................

13

Протокол 2.2.12. Прижизненная окраска митохондриальной ДНК в

клетках дрожжей............................................................................................

13

2.3. Иммуноцитохимия...........................................................................................

14

Таблица 2.1. Фиксаторы, используемые для иммуноцитохимии.........

16

Протокол 2.3.1. Обработка предметных стекол желатином..................

17

Протокол 2.3.2. Непрямое иммуноцитохимическое окрашивание......

18

2.4. Включение меченых предшественников в реплицирующуюся ДНК.........

19

Протокол 2.4.1. Получение метафазных хромосом высокого

разрешения......................................................................................................

20

Протокол 2.4.2. Выявление репликационного бэндинга окраской

акридиновым оранжевым............................................................................

21

Протокол 2.4.3. Иммунохимическое выявление включенного brdu ...

21

2.5. Мечение нуклеиновых кислот in situ .............................................................

22

Протокол 2.5.1. Выявление однонитевых разрывов ДНК методом ник-

трансляции in situ ..........................................................................................

23

Протокол 2.5.2. Денатурация ДНК на препарате....................................

24

Протокол 2.5.3. Лигирование разрывов хромосомной ДНК.................

25

Протокол 2.5.4. Застройка брешей ДНК термостабильной полимеразой

...........................................................................................................................

25

Протокол 2.5.5. Затупление 3’-концов дидезоксирибонуклеотидами..

25

Протокол 2.5.6. Полимеразная реакция in situ (PRINS).........................

26

Протокол 2.5.7. Мечение РНК транскриптов in situ (RT-PRINS).........

27

Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов

68

2.6. Флуоресцентная гибридизация in situ............................................................

28

Протокол 2.6.1. Обработка стекол аминопропилтриэтоксисиланом ..

29

Протокол 2.6.2. Получение препаратов метафазных хромосом из

культуры клеток фибробластов .................................................................

29

Протокол 2.6.3. Фиксация тканей для приготовления парафиновых

срезов................................................................................................................

30

Протокол 2.6.4. Предобработка препаратов рнказой А..........................

31

Протокол 2.6.5. Предобработка препаратов пепсином...........................

31

Протокол 2.6.6. Предобработка препаратов протеиназой К .................

31

Протокол 2.6.7. Постфиксация препаратов перед гибридизацией.......

32

Протокол 2.6.8. Мечение ДНК-зондов методом ник-трансляции.........

33

Протокол 2.6.9. Оптимизация размеров меченых фрагментов............

34

Протокол 2.6.10. Олигомечение ДНК со случайными праймерами....

35

Протокол 2.6.11. Мечение зондов методом ПЦР......................................

36

Протокол 2.6.12. Очистка ПЦР продукта .................................................

37

Протокол 2.6.13. Использование вырожденных праймеров для

получения первичного амплификата (DOP-ПЦР) ..................................

38

Протокол 2.6.14. Получение меченых РНК зондов .................................

39

Протокол 2.6.15. Оценка эффективности мечения зонда.......................

40

Протокол 2.6.16. Растворение зонда в гибридизационном буфере.......

42

Протокол 2.6.17. Отмывка препаратов после гибридизации................

44

Протокол 2.6.18. Иммунохимическая детекция гибридизовавшегося

зонда.................................................................................................................

44

Таблица 2.2. Схема M-FISH на хромосомах человека с 6

флуорохромами..............................................................................................

47

Таблица 2.3. Схема идентификации хромосом человека методом

репробинга с 3 флуорохромами ..................................................................

47

2.7. Флуоресцирующие белки................................................................................

48

Таблица 2.4. Список клонированных флуоресцирующих белков .......

49

Таблица 2.5. Некоторые варианты флуоресцирующих белков на

основе GFP ......................................................................................................

50

ГЛАВА 3. РЕГИСТРАЦИЯ И АНАЛИЗ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ИЗОБРАЖЕНИЙ ..........................

53

3.1. Фотографирование...........................................................................................

53

3.2. Цифровая система фиксации изображения...................................................

54

3.3. Методы хранения и обработки цифровых изображений .............................

56

ПРИЛОЖЕНИЯ......................................................................................................................

59

Приложение 1. Спектры флуорохромов ..............................................................

59

Приложение 2. Буферные растворы ....................................................................

66

1х PBS (ph 6,0).................................................................................................

66

1х PBS (ph 6,8-7,2)...........................................................................................

66

20x SSC (ph 7,0)...............................................................................................

66

Ацетатный буфер (ph 4,2).............................................................................

66

Фосфатный буфер Зёренсена (ph 5,5).........................................................

66

Фосфатный буфер Зёренсена (ph 6,8).........................................................

66

Буфер Макильвейна ph (6,8-7,0) .................................................................

66

Буфер Макильвейна (ph 7,3)........................................................................

66

ОГЛАВЛЕНИЕ.......................................................................................................................

67