Maldi Biotyper.

В 2010 году произошло событие, которое специалисты в области клинической микробиологии назвали «революцией» в области микробиологии. Принципы ионизации макромолекул - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ), предложенные Джоном Фенном (Virginia Commonwealth University, Richmond, USA) и Коичи Танаке (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) за которые они получили в 2002 году нобелевскую премию позволили создать микробиологический анализатор в основе которого лежит масс-спектрометрия белковых молекул и нуклеиновых кислот - MALDI Biotyper. Система MALDI BioTyper идентифицирует микроорганизмы в течение нескольких минут, сравнивая получаемые масс-спектры белковых молекул со стандартными базовыми профилями в сети интернет, постоянно пополняющимися и уже позволяющими осуществлять четкую идентификацию тысяч видов бактерий, мицелиальных и дрожжевых грибов (рис.8.)

Сочетание масс-спектрометрии с минисеквенированием, осуществляемым на базе стандартной ПЦР лаборатории, позволяет выполнять молекулярно-генетические исследования механизмов резистентности и эпидемиологическое типирование микроорганизмов. Качество исследований гарантирует постоянный контроль через сеть интернет основных рабочих параметров системы специалистами производителя. Это первый микробиологический анализатор, практически не требующий дополнительных затрат на закупку расходных материалов и обучение персонала. Методика непрерывно развивается. В настоящее время проводятся кинические испытания методик с использованием MALDI Biotyper для идентификации микроорганизмов непосредственно в моче, а также методика прямого исследования культур крови.

MALDI Biotyper зарегистрирован как технология для диагностики in vitro (IVD сертификат). На сегодняшний день около 160 лабораторий в США, Германии, Бельгии, Франции и России используют технологию MALDI Biotyper в рутинной практике. Среди Российских пользователей следует отметить такие учреждения как Центральный НИИ туберкулеза, Государственный научный центр дерматовенерологии, НИИ Антимикробной терапии Смоленской Медицинской Академии, Медико-генетический центр РАМН, НЦ акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова, Красноярский государственный медицинский университет.

MALDI Biotyper позволяет решить все задачи практической микробиологи по идентификации, оценке степени вирулентности, резистености к АМП и эпидемиологическому типированию штамма с целью выявления источника инфекции в течение 2 суток. Причем одни сутки нужны для выделения микроорганизмов из исследуемого материала классическим методом посева на питательные среды. Прямая идентификация непосредственно в образце ткани, выделениях, воде, воздухе, пищевых продуктах сократят время решения этих задач до нескольких часов [47].

Биохимическая идентификация бактерий основана на выявлении ферментов.

Известно более 2000 ферментов. По катализируемым реакциям они объединены в шесть классов:

1. оксидоредуктазы — окислительно-восстановительные ферменты (к ним относят дегидрогеназы, оксидазы и др.);

2. трансферазы, переносящие отдельные радикалы и атомы от одних соединений к другим;

3. гидролазы, ускоряющие реакции гидролиза, т.е. расщепления веществ на более простые с присоединением молекул воды (эстеразы, фосфатазы, глюкозидазы и др.);

4. лиазы, отщепляющие от субстратов химические группы негидролитическим путем (карбоксилазы и др.);

5. изомеразы, превращающие органические соединения в их изомеры (фосфогексоизомераза и др.);

6. лигазы, или синтетазы, ускоряющие синтез сложных соединений из более простых (аспарагинсинтетаза, глютаминсинтетаза и др.).

Эндоферменты- катализируют метаболизм проходящий внутри клетки. Экзоферменты- выделяются клеткой в окружающую среду. Конститутивные ферменты постоянно синтезируются в определенных концентрациях. Индуцибельные ферменты – это ферменты, концентрация которых увеличивается при поступлении соответствующего субстрата. По разлагаемым субстратам: 1) протеолитические 2) сахаролитические 3) липолитические

Ферменты агрессии 1) инвазивности гиалуронидаза, фибринолизин, нейраминидаза, коллагеназа и др.

2) агрессивности лецитиназа (лицитовителлаза), коагулаза, уреаза, аминокислотные декарбоксилазы, ДНК-аза и др.

КАТАЛАЗА, название, данное Левом (Loew) в 1901г. ферменту, разлагающему Н₂0₂ на воду и молекулярный кислород. Лев выделил его из экстракта табачных листьев фермент, разлагающий Н₂0₂ и назвал его каталазой. Существование органического катализатора, обладающего способностью разлагать Н₂0₂, было известно уже Тенару (Thenard), который в 1818 году сообщил, что частицы разных животных тканей подобно благородным металлам способны разлагать Н₂0₂.

Приготовление К. Исходным материалом для приготовления К. может служить любая животная или растительная ткань, т. к. К. содержится во всех клетках аэробных организмов, но на практике пользуются теми тканями или органами, которые отличаются особенно значительным содержанием К., как напр. печень лошади, быка и барана. Наиболее простой способ приготовления весьма активных препаратов—это способ Бателли и Штерн: экстрагирование 2—3 объемами воды тонко измельченной печени, осаждение полученного экстракта 2 объемами этилового алкоголя, вторичное экстрагирование водой полученного осадка, фильтрация и вторичное осаждение фильтрата 2 объемами этилового алкоголя. Высушенный при комнатной t° осадок проявляет большую активность: 1 г этого порошка способен разложить в 5 мин. при комнатной t° около 3 кг чистой Н₂0₂, выделяя около 1.000 л 02. Приготовленные по этому способу каталазные препараты (гепатокаталаза Бателли и Штерн) сохраняют полную активность в течение многих лет (больше 20 лет).

КАТАЛАЗЫ у анаэробных бактерии нет, у аэробных в содержании каталазы отмечаются значительные колебания не только у разных видов, но и у одного и того же вида. Роль и физиологическое значение каталазы до сих пор не выяснены. Из выставленных разными авторами гипотез ни одна не оказалась вполне удовлеторительной. При широкой распространенности этого фермента можно предположить, что он играет важную роль в общем химизме клетки и в виду параллелизма между наличием этого фермента и оксибиозом организма также логично предположить, что он должен иметь существенное, значение именно при окислительных процессах.

8