(Этапы).

1 Этап ВЫДЕЛЕНИЕ ФАГА: Фильтрация исследуемого материала через бактериальные фильтры, нагревание до 75°С и /или обработка хлороформом с целью устранения сопутствующей микрофлоры

2. Этап ИНДИКАЦИЯ ФАГА: полученный фильтрат вносят: а) в пробирку с бульонной культурой микроорганизма (например E.coli) к которому мы хотим выделить вирулентный бактериофаг; б) на чашку с МПА засеянной микроорганизмом :

А) на жидких питательных среда просветление бульона свидетельствует о присутствии фагов

Б) на плотных средах; зоны лизиса свидетельствуют о присутствии фагов

3 ЭТАП ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФАГА в исследуемом фильтрате качественными пробами по методам Фишера, Фюрта, и Отто ( «стекающая капля »).

3.1 Метод Фишера (идентификация) Неизвестный фаг наносится на поверхность засеянной на МПА культуры микроба Вывод : это бактериофаг E.coli	1. S.flexneri (дизентерия) 2. S.sonnei (дизентерия) 3. S. Typhi (брюшной тиф ) 4. E.coli Зона лизиса Отсутствие роста	3.2 Метод Фюрта (идентификация) Неизвестный фаг вносится в расплавленный и остуженный агар, на который штрихом засевают культуры микроба Вывод : это бактериофаг S.sonnei
3.3 Метод «стекающей капли» по Отто (идентификация ) На чашку с МПА засевают газоном кишечную палочку и пипеткой наносят исследуемый фильтрат. Инкубация в термостате. Вывод: исследуемый фильтрат содержит бактериофаг E.coli		E.coli (газон) лизис культуры

4 Этап определение количественного содержания и активности фага

Титрование это определение количественного содержания бактериофага в исследуемом материале. Для этого пользуются двумя показателями: количеством активных частиц бактериофага, содержащихся в 1 мл исследуемого материала, или величиной наибольшего разведения, при котором бактериофаг проявляет свое литическое действие. Полученную при этом величину выражают отрицательным логарифмом 10, где степень указывает разведение фага.

4.1Определение титра активности фага в жидкой питательной среде (пробирках) по Аппельману основано на внесении различного количества титруемого бактериофага в бульон, засеянный одной и той же дозой культуры гомологичных микробов, с целью получения феномена бактериофагии.

Разве-дения фага

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

10-9

10-10

КК

КФ

Лизис

Лизис +

Лизис +

Лизис +

Лизис +

Лизис +

Лизис +

Лизис +

Лизис +

Муть-

Муть--

Муть---

Лизис +

Результат: (+) - фаголизис индикаторного штамма ; - муть -рост индикаторного штамма

Вывод: Титр активности бактериофага равен 10^-8

3.2 Определение количества фага методом агаровых слоев по Грациа

Количество бактериофагов выражают в количестве бляшкообразующих единиц на 1 мл исследуемого материала (БОЕ / мл). Бляшки – это зоны отсутствия роста бактерий в местах нанесения фага. Для расчета содержания количества бактериофагов в 1 мл фаголизата необходимо умножить количество негативных колоний в газоне индикаторной бактериальной культуры на разведение исследуемого материала.

Пример расчета: на чашке Петри из1мл разведения 10^-3 образовалось 43 негативных колонии(бляшек).В 1мл фаголизата содержится 43 х 10 ³=43 000 фаговых частиц, т.е концентрация бактериофагов в фаголизате 43 000 БОЕ / мл

Практическое использование бактериофагов:В РФ выпускают бактериофаги для лечения и профилактики 1) кишечных инфекций — дизентерийный поливалентный, сальмонеллезный, брюшнотифозный, 2) гнойно-воспалительных заболеваний — стафилококковый, стрептококковый, синегнойный, протейный, клебсиеллезный, коли-фаг. Разработаны и комбинированные препараты из нескольких видов бактериофагов: коли-протейный, пиобактериофаг (против стафилококков, стрептококков, клебсиелл, протея, синегнойной и кишечной палочек), интести-фаг (против шигелл, сальмонелл, стафилококков, энтерококков, кишечной и синегнойной палочек, протея). 3.Фагодифференцировка для дифференциации видов бактерий cхожих по биохимической активности (например сальмонелл и бактерий рода Citrobacter)

4. Фаготипирование для выявления источника инфекции при стафилококковых инфекциях и брюшном тифе, так как фаги штаммоспецифичны и лизируют бактерии происхождением из одного источника

Фаготипирование стафилококков набором из 21 фагов (80, 79, 52А, 52, 29, 71, 55, 3С, 3В, 3А, 53,47,42Е, 7, 6, 42Д, 77,75, 83А, 54, 81, 187).
Штамм N1 S. aureus 3В/53/81;	Штамм N2 S. aureus 3В/42E/187
На штаммы S.aureus, посеянные газоном, в квадраты нанесены капли индикаторных стафилококковых фагов (21 фаг). Разные фаготипы стафилококков свидетельствуюто разных источниках заражения, одинаковые о едином источнике. (Например, совпадение фаготипа стафилококков, выделенных из послеоперационной раны и с поверхности хирургического инструмента или с рук хирурга указывает на источник инфекции.)