ЗАНЯТИЕ № 13

ТЕМА: СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ КОМПЛЕМЕНТА. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНЫХ КОМПОНЕНТОВ. РАДИОАКТИВНЫЕ, ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЕ, ФЕРМЕНТНЫЕ МЕТКИ.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

1. Реакции иммунного лизиса и связывания комплемента: методика постановки, учета и оценки, применение в диагностике инфекционных заболеваний.

2. Реакции иммунофлюоресценции. Диагностическое значение, информативность, варианты постановки реакций: прямой и непрямой.

3. Иммуноферментный анализ. Варианты постановки. Возможные ошибки и ограничения метода, иммуноферментного анализа.

4. Иммуноблотинг (вестерн- блотинг). Проведение и учет результатов. Варианты применения метода.

5. Радиоиммунный анализ, сущность, способы постановки, методы учета и оценки реакций, достоинства и недостатки метода.

ЛАБОРАТОРНАЯ И САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА

1. Реакция иммунного бактериолиза (РИБ) - лизис бактерий в присутствие специфических антител и комплемента (использовали для диагностики холеры, сифилиса и лептоспироза)

Ингредиенты РИБ: антиген (представлен на клеточной стенке бактерий); б) антитела (в данном случае их называют бактериолизины) иммунной сыворотки в) комплемент

Исследуемый материал: сыворотка крови пациента при подозрении на заболевание

Диагностические препараты:1. Взвесь суточной культуры известных бактерий – диагностикум из живых бактерий (лептоспир) содержит антиген (представлен на клеточной стенке бактерий) 2. Комплемент – коммерческий препарат получают из сыворотки крови морских свинок

Варианты постановки: in vitro (в пробирках ) и in vivo (на морских свинках).

Ингредиенты	опыт	контроль
	1	антигена	комплемента
Сыворотка крови обследуемого прогретая при 56º 30 мин 1:10	0,5	0,5	-
Антиген из живых лептоспир ~ 1 млрд. бактерий в 1 мл	0,1	0,1	0,1
Комплемент	0,1	-	0,1
Физиологический р-р		0,1	0,5
Результат: лизис +/-	Лизис+	Лизис-	Лизис-

В настоящее время используют для только in vitro и только для диагностики лептоспирозов. Для этого к 0,2 мл разведенной сыворотки (1:100, 1:200 ,1:400,1:800 и т.д) обследуемого добавляют 0,2 мл взвеси культуры лептоспир инкубируют 2 часа в термостате и микроскопируют в темном поле. Лизис характеризуется сильным набуханием и зернистостью лептоспир, потерей подвижности с последующим распадом на отдельные зерна, которые иногда полностью растворяются. Лизис лептоспир сывороткой крови обследуемого пациета в титрах 1:200 и выше позволяет подтвердить диагноз лептоспироза (Leptospira interrogans)

2. Реакция иммунного гемолиза - лизис эритроцитов в присутствие специфических антител и комплемента

Ингредиенты реакции гемолиза: 1. 3% взвесь эритроцитов барана (антиген); 2. Гемолитическая сыворотка- (гемолизин) антитела против эритроцитов барана готовят на производстве, иммунизируя кролика эритроцитами барана, затем сыворотку лиофилизируют и на этикетке указывают титр

3. Комплемент – коммерческий препарат получают из сыворотки крови морских свинок

Цель применения: определение титра комплемента - наибольшего разведения комплемента, который вызывает полный гемолиз эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки

Ингредиенты	Номер пробирки										Контроль
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	КГС	КЭ
Комплемент в разведении 1:10	0,05	0,1	0,15	0,2	0,25	0,3	0,35	0,4	0,45	0,5	-	-
Физиологический раствор	1,45	1,4	1,35	1,3	1,25	1,2	1,15	1,1	1,05	1,0	-	-
Гемолитическая система	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Результ: Гемолиз +/-	Гем+	Гем+	Гем+	Гем+	Гем+	Гем-	Гем-	Гем-	Гем-	Гем-	Гем-	Гем
Титр комплемента

Титрование комплемента тип реакции реакция иммунного гемолиза Вывод: Титр комплемента составляет 0,25 мл Рабочая доза комплемента на 20-25% выше титра (обычно берут предыдущее разведение), равна 0,2

3. Реакция связывания комплемента (рск)

Титрование гемолитической сыворотки: тип реакции Реакция иммунного гемолиза

Титр гемолитической сыворотки - максимальное ее разведение, обеспечивающее полный гемолиз эритроцитов в присутствии комплемента. Рабочая доза гемолитической сыворотки в 3-4 раза выше титра.

Ингредиенты РСК: 1. исследуемая сыворотка 2. антиген - взвесь убитых бактерий 3. комплемент (сыворотка кролика или морской свинки 4. гемолитическая система состоящая из : а) гемолитической сыворотки (сыворотка кролика, иммунизированного эритроцитами барана) б) эритроцит антигена - 3% взвеси эритроцитов барана

Основной опыт рск (изучить схему постановки)

Ингредиенты, мл	пробирки
	опыт	Полж. к-ль	Отр. к-ль	К-ль сывор	К-ль антг.	К-ль компл	К-ль ГC
	1	2	3	4	5	6	7
Испытуемая сыворотка в разведении 1:5	0,2	-	-	0,2	-	-	-
Положительная сыворотка	-	0,2	-	-	-	-	-
Отрицательная сыворотка	-	-	0,2	-	-	-	-
Антиген	0,2	0,2	0,2	-	0,2	-	-
Изотонический раствор хлорида натрия	-	-	-	0,2	0,2	0,4	0,6
Комплемент (в рабочей дозе)	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	-
Инкубация на холоде при t - 0-4 0С в течение 18-20 час. или при t-37 0С в течение 30 минут
Гемолитическая система	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Инкубация при 370С в течение 20-30мин. (до гемолиза в контроле)
Результат	Гем-	Гем-	Гем+	Гем+	Гем+	Гем+	Гем-

Вывод: Исследуемая сыворотка содержит антитела против используемого антигена

Цель применения РСК: 1.для экспресс диагностики выявления микробных антигенов (обнаружения бактерий ) в материале от больного (например при диагностике гонореи исследуется моча, секрет предстательной железы, гнойные выделения из шейки матки; 2 для выявления антител (диагностики заболеваний ) в сыворотке крови больного (например при диагностике сыпного тифа);

Применение РСК в экспресс-диагностике для выявления микробных антигенов (гонорея).

Исследуемый материал: гнойные выделения больного, содержит микробные антигены (гонококков)

Диагностические препараты: 1. антититела против бактерий (полученные иммунизацией животных)

2. комплемент (сыворотка кролика или морской свинки 3. гемолитическая сыворотка (сыворотка кролика, иммунизированного эритроцитами барана) 4. 3% взвесь эритроцитов барана

Применение РСК в серодиагностике сыпного тифа.

Исследуемый материал: кровь больного, содержит антитела против риккетсий Провачека – возбудителя сыпного тифа

Диагностические препараты: 1. риккетсиозный корпускулярный антиген 2. комплемент (сыворотка морской свинки) 3. гемолитическая сыворотка (сыворотка кролика, иммунизированного эритроцитами барана) 4. 3% взвесь эритроцитов барана