3. Метод оценки в-системы.

►Количественная оценка.

Определение количества в-лимфоцитов методом розеткообразования с эритроцитами мыши.

Принцип метода: На 1 этапе из крови выделяют лимфоциты. На 2 этапе с помощью реакции розеткообразования с эритроцитами мыши определяют процент В-лимфоцитов от общего числа лимфоцитов. При добавлении к суспензии лимфоцитов эритроцитов мыши, последние адсорбируются В-лимфоцитами, а образующиеся при этом структуры называются розетками. Общее количество лимфоцитов подсчитывают под микроскопом по количеству розеток.

Препарат Кровь обследуемого пациента в количестве 10 мл вносят в пробирку с раствором гепарина и осторожно наслаивают на смесь фиколл-гипака, который способствует выделению лимфоцитов, и центрифугируют. После центрифугирования эритроциты оседают на дно пробирки, а лимфоциты располагаются тонким слоем на границе раствора фиколл-гипака и плазмы. Взвесь лимфоцитов осторожно извлекают из этого слоя (интерфазы), доводят до концентрации 2–4x106/мл (2–4x109/л) и смешивают с взвесью эритроцитов барана в соотношении 1:1. Полученную смесь инкубируют при 37°С в течении 10 минут и снова центрифугируют, после чего выдерживают в холодильнике при температуре 4 °С в течение нескольких часов. Подсчет клеток производят в камере Горяева при люминесцентной микроскопии. Подсчитывают число “розеток” на 100 лимфоцитов и определяют процентное содержание Т-лимфоцитов. Для определения абсолютного количества Т-лимфоцитов в день исследования производят общий клинический анализ крови. В норме содержание Т-лимфоцитов в периферической крови колеблется от 50 до 70% от общего количества лимфоцитов (в среднем 54,3±1,0%). Окраска по Романовскому Увеличение 900 Метод выявляет маркер CD 20 на поверхности В-лимфоцитов; Содержание В-лимфоцитов – (CD 20) = 8-20% от общего числа лимфоцитов.

►Качественная (функциональная) оценка

Определение концентрации иммуноглобулинов g класса в сыворотке крови методом простой радиальной иммунодиффузии по Манчини (в реакции преципитации).

Принцип метода: На стеклянную пластинку (или чашку Петри) наливают агар, смешанный с антителами против IgG. После застывания в агаре делают лунки диаметром 2 мм. В один ряд лунок вносят разведения стандартной сыворотки с известной концентрацией IgG. В другие лунки добавляют исследуемые сыворотки крови больных. Иммуноглобулины диффундируют в агар и на месте встречи с антителами, которые находятся в агаре, образуется зона кольца преципитации. Диаметр этого кольца зависит от концентрации Ig (чем больше Ig, тем больше диаметр). Измеряют диаметр зоны преципитации для трех разведений стандартной сыворотки и по ней на полулогарифмической бумаге строят график зависимости квадрата диаметра кольца преципитации (Д) от количества Ig в сыворотке крови. Затем измеряют диаметр кольца преципитации исследуемой сыворотки, наносят на построенный график и определяют концентрацию Ig. Стандарт IgG = 10-20 г/л.

Заключение __________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________

Реакция Кумбса - это антиглобулиновый тест для определения неполных антиэритроцитарных антител. Используется для выявления антител к резус-фактору у беременных женщин и определения гемолитической анемии у новорождённых детей с резус-несовместимостью, влекущей разрушение эритроцитов. Данный метод был предложен английским врачом Робертом Кумбсом в 1945 году, в связи с чем впоследствии получил название "реакция Кумбса".

Антиглобулиновая сыворотка - реагент, необходимый для проведения теста Кумбса. В состав антиглобулиновой сыворотки входят антитела к иммуноглобулинам человека. Сыворотка взаимодействует с эритроцитами, сенсибилизированными неполными антителами, что приводит к их агглютинации.