2.1.1 Концентрат гелю – 15 %(14% т, 1% с):

1. Акриламід – 13, 93 % розчин (13, 93 г розчинити у 50 мл дистильованої води)

2. Бісакриламід - 1,07% розчин (1,07 г розчинити у 13.93 % розчині акриламіду та довести дистильованою водою до 100 мл)

Розчин обов'язково профільтрувати. Зберігати при +4°С не більш 3-х місяців.

2.1.2 Буфер для концентруючого гелю ( рН 6,8):

1. 0,5 М Трис-НCl (11,96 г Трис + 80 мл води + 96 мл 1 н НCl – довести до 200 мл дистильованою водою).

2. Додатки (108 г сечовини + 77,4 мг аскорбінової кислоти – довести до 200 мл 0,5 М Трис-НCl буфером)

3. 0,4% SDS (розчинити 400 мг SDS у 100 мл 0,5 М Трис-НCl буферу з додатками)

4. рН доводити перед додаванням SDS. Зберігати при +4°С.

3. Буфер для поділяючого гелю (рН 8,8):

1. 1,5 М Трис-НCl (36, г Трис + 40 мл води + 48 мл 1 н НCl – довести до 100 мл дистильованою водою).

2. Додатки (54 г сечовини + 38, 6 мг аскорбінової кислоти – довести до 100 мл 1,5 М Трис-НCl буфером)

3. 0,4% SDS (розчинити 400 мг SDS у 100 мл 1,5 М Трис-НCl буферу з додатками)

4. рН доводити перед додаванням SDS. Зберігати при +4°С.

2.1.4 Анодний буфер для електрофорезу (рН 8,6):

1. 0,025 М Трис-НCl – 0,192 М гліциновий буфер (48,8 г гліцину розчиняють у 1 000 мл дистильованої води та додають 6 г Трису, потім об’єм доводять водою до 2 000 мл).

2.1.5 Катодний буфер для електрофорезу (рН 8,6):

1. 0,025 М Трис-НCl – 0,192 М гліциновий буфер з додаванням 0,1% SDS (1 г SDS розчиняють у 1 000 мл 0,025 М Трис-НCl – 0,192 М гліцинового буферу)

2. 0,001 % розчин бромфенолового синього (0,001 г бромфенолового синього доводять до 100 мл дистильованою водою та фільтрують). Зберігають при + 4 ⁰С.

3. 0,025 М Трис-НCl – 0,192 М гліциновий буфер з додаванням 0,1% SDS та бром феноловим синім (до буферу додають 2 мл 0,001 % розчину бромфенолового синього).

4. рН доводити перед додаванням SDS. Зберігати при +4°С.

6. Буфер для зразків:

1. Розчин А (до 100 мл концентруючого гелю додають 0,46 мл ТЕМЕДа)

2. Розчин Б (44 г сечовини довести до 100 мл дистильованою водою)

3. Уважнювач з додаванням 2 % SDS та 5 % β-меркаптоетанолу (2 мл розчину А + 8 мл розчину Б + 0,2 г SDS та 0,5 мл β-меркаптоетанолу)

4. Зберігати при -20°С не більш 6 місяців.

2.2 Заливання гелю:

2.2.1 Поділяючий гель (12,5%):

1. Розчин акриламідного гелю (6,25 мл концентрату гелю (див. 2.1.1) + 3,75 мл буферу для поділяючого гелю (див. 2.1.3) + 2,5 мл дистильованої води)

2. Розчин персульфату амонію (8 мг персульфату амонію розчинити у 2,5 мл дистильованої води)

3. Поділяючий гель (з’єднати розчини акриламідного гелю з 9 мкл ТЕМЕДу та додати для полімеризації розчин персульфату амонію)

2.2.2 Концентруючий гель (4 %):

1. Розчин акриламідного гелю (2 мл концентрату гелю (див. 2.1.1) + 2,5 мл буферу для концентруючого гелю (див. 2.1.2) + 3 мл дистильованої води)

2. Розчин персульфату амонію (7 мг персульфату амонію розчинити у 2,5 мл дистильованої води)

3. Концентруючий гель (з’єднати розчини акриламідного гелю з 8 мкл ТЕМЕДу та додати для полімеризації розчин персульфату амонію)

3. Підготовка зразків

Водний розчин білку змішати з буфером для зразків (див. 2.1.6) у співвідношенні 1:2та витримують 5 хвилин за температури 90-95 ⁰С.

3. Розчин для фіксації й фарбування гелю

2.4.1 Розчини для фіксації

1. Суміш 5 % розчину трихлороцтової кислоти (ТХО) та 5 % розчину сульфосаліцилової кислоти (5 г ТХО та 5 г сульфосаліцилової кислоти розчинити у 100 мл води). Гель витримувати у цьому розчині на протягом 30-60 хвилин.

або

2. 70 % розчин ізопропанолу (70 мл ізопропанолу довести до 100 мл дистильованою водою). Гель витримувати у цьому розчині на протягом 30-60 хвилин.1 – 3 годин

2.4.2 Розчини для фарбування (час фарбування – 2-3 години)

1. 1 % розчин Кумасі R-250 (10 г фарби розчиняють у 1 000 мл дистильованої води) Фарбу профільтрувати. Зберігати в щільно закритій пляшці при температурі +4 ⁰С.

2. 10 % розчин сульфосаліцилової кислоти (100 г сульфосаліцилової кислоти доводять дистильованою водою до 1 000 мл)

3. 10 % розчин трихлороцтової кислоти (100 г ТХО доводять дистильованою водою до 1 000 мл)

4. Змішують 1 об’єм 1 % розчин Кумасі R-250 та по 8,5 об’ємів 5 % розчин сульфосаліцилової кислоти та 5 % розчин трихлороцтової кислоти.

або

5. 40 % розчин ізопропанолу (400 мл ізопропанолу доводять до 1 000 мл дистильованою водою)

6. 20 % розчин оцтової кислоти (200 мл оцтової кислоти доводять до 1 000 мл дистильованою водою)

7. 0,04 % розчин Кумасі R-250 (0,4 г фарби розчиняють у 1 000 мл суміші 40 % розчин ізопропанолу та 20 % розчин оцтової кислоти (1:1)